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本年度はWGEF遺伝子の相同組み替え用ターゲティングベクターの作成を行った。ターゲティングベクターはWGEFの遺伝子配列をもとに、Exon2の下流に選択マーカーとしてLoxPサイトをもつneoカセットを導入し、上流側にLoxPサイトを組み込むことによってCreによるWGEFのコンディショナルな遺伝子破壊を起こさせるようデザインした。ターゲティングベクターの作成は、BACの修飾法を用いて行った。薬剤選択のカセットを含む、BAC修飾用のベクターにWGEFの配列を組み込み、修飾用ベクターの配列とBACの配列で組み換えを起こすことによって、BAC cloneに目的のLoxPサイトと、neoカセットを組み込んだ。最終的にDTAを含むES細胞導入用のベクターに目的の断片を挿入し、WGEFコンディショナルノックアウトマウスのターゲティングベクターを作出することに成功した。また、ES細胞の相同組み替え体のスクリーニング条件を検討するため、スクリーニングに使うPCR領域を含む断片をクローニングしたコントロールベクターを作製し、ES細胞に導入して、実際にスクリーニングに用いるプライマーでPCRを行った。その結果、スクリーニングに最適なprimerペアとPCR条件が決定できた。この条件をもとに、ターゲティングベクターをES細胞に導入して、neomycin耐性クローンを選択し、相同組み替えESクローンのスクリーニングを行った。PCR法により、全400クローンをスクリーニングしたが、組み替えクローンを得ることはできなかった。今年度はクローン数をスケールアップすることにより、組み替えESクローンを取得した後ノックアウトマウスを作出し、交配によってノックアウトマウスを得る。
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