| 研究課題/領域番号 |
20H00335
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
藤原 正澄 岡山大学, 自然科学学域, 研究教授 (30540190)
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| 研究分担者 |
松原 勤 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20628698)
中台 枝里子 (鹿毛枝里子) 大阪市立大学, 大学院生活科学研究科, 教授 (40453790)
鹿野 豊 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (80634691)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 蛍光ナノダイヤモンド / 温度測定 / 光検出磁気共鳴 / C. elegans / 細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、生物個体内の温度を細胞レベルの空間分解能で捉えるリアルタイム３次元温度計測顕微鏡を開発し、温度にもとづく生命活動の定量化を実現することを目的としている。次の主要3点について進捗報告を行う。
①広視野・３次元・高速化技術・局所加熱技術の実装：今年度、広視野蛍光ナノダイヤモンドスピン測定の高速化に取り組み、従来の2～3倍の測定速度向上を実現した。また、多点ODMR計測を広視野顕微鏡に実装し、視野全体でのリアルタム温度測定が可能となった。一方で、リアルタイム測定中の様々なアーティファクトが明らかとなり、焦点補正フィードバック機構の導入などが必要な状態である。これらの他に、マイクロ波照射系の設計を詳細に見直すことで、広領域において精度良く蛍光NDのODMR信号を予測することに成功した。この成果は、Lab on a Chip誌に受理された（掲載準備中）。
②線虫のNDラベリングプロトコル：培養細胞において導入効率が最も高い表面修飾NDが、線虫の腸内においても最も滞留時間が長いことが明らかとなった。一方で、線虫の成長ステージによって滞留速度が変わることなど、培養細胞に比べてより複雑な挙動を示すことも明らかとなった。表面修飾をすれば、NDでも磁性ナノ粒子など他のナノ粒子でも同様の挙動を示すことから、現在、複数のナノ粒子を用いて系統的に実験を行っている。
③線虫のカルシウムイメージング：本研究では、線虫の局部精密加熱と神経活動の相関を得ることを目指している。神経活動のモニタリングのために、カルシウム指示性のあるGCaMPを発現した遺伝子組換え線虫の実験が必要であり、遺伝子組み換え研究に関する必要な手続きを半年ほどかけて終え、P1A実験室を整備した。そして、カルシウム活性信号の検出を行うマイクロ流路系作成し、実験を行った。現在データ解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究は順調に進展している。1年目の終了時点で、線虫個体内における蛍光ナノダイヤモンド温度計測を実現し、本研究プロジェクトで重要な広視野蛍光顕微鏡などの装置群を導入した。今年度は、4年間の2年目終了中間地点であったが、広視野・３次元・高速化技術を有するODMR顕微鏡の試作機がすでに完成している。また、線虫のNDラベリングプロトコルに関しても、体内におけるナノ粒子の挙動を大規模に実験・分析した結果、ナノ粒子が体内に24時間以上対流する条件を見出した。これにより、局所温度計測の実験が可能なvivo系が整ったといえる。また、カルシウムイメージングに関しても、P1Aなどの実験設備整備を完了し、組換え体の蛍光観察などができるようになった。論文発表としても、Advanced Functional Materials誌、Lab on a Chip誌という重要雑誌に成果が発表された。学会発表においても、複数の招待講演での発表を行った。これらのことから、当初の予定通りの進捗を見せていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は次の2点について研究・開発を実施する。
①広視野・３次元・高速化技術・局所加熱技術の実装：これまでの研究で、多点ODMR測定が実現できているが、焦点ズレなどによるアーティファクトが発生することが明らかとなっている。これに対して、焦点補正フィードバック機構を導入し、補償光学技術や画像解析技術を駆使することでアーティファクトを除去する予定である。局所加熱については、既に視野上において任意のレーザーパターンを生成する装置、および、加熱レーザーを導入しており、顕微鏡への導入を今年度行う。
②線虫のNDラベリングプロトコル：線虫体内に滞留する蛍光NDの場所を特定するために、電子顕微鏡による解析を行う。また、より効率的な蛍光ND導入を実現するために、腸管内の分子環境を調査し、最適な手法を探索する。これらに加えて、これまでに観測されているデータを定量化するために、大規模系統化実験をデザインして、知見を定量化し、論文化する。
③線虫のカルシウムイメージング：すでにマイクロ流路に捕捉された線虫の神経細胞蛍光モニタリングには成功している。GCaMPによる蛍光変化を捉えるために、光刺激などの物理刺激と組み合わせることで、カルシウムイメージングの測定を行う。カルシウムイメージングと局所加熱および蛍光ND温度計測を組み合わせる所までを今年度行う。
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