生体内一細胞温度計測による定量熱生物学の開拓

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20H00335
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 藤原 正澄 岡山大学, 学術研究院自然科学学域, 研究教授 (30540190)
• 研究分担者: 松原 勤 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20628698) ; 中台 枝里子 (鹿毛枝里子) 大阪公立大学, 大学院生活科学研究科, 教授 (40453790) ; 鹿野 豊 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (80634691)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 蛍光ナノダイヤモンド / 温度測定

研究実績の概要

①広視野・３次元・高速化技術・局所加熱技術の実装：今年度、これまで構築してきた広視野蛍光ナノダイヤモンドスピン測定を温度測定に実際に実装し、温度イメージングを可能とした。カメラの露光時間や読み出し速度の最適化作業を重ね、温度精度１℃程度での測定に成功している。また、測定中に焦点がずれる問題に関しても、自動焦点機能を取り込ませることに成功し、例えば、100倍の油浸対物レンズで焦点が10um程度シフトしても追尾することが可能となった。局所加熱に関しても、生きた線虫をライブ映像で確認しながら、狙った点に近赤外レーザーをピンポイント照射することができるようになった。
②線虫へのナノ粒子導入：前年度までに、線虫内への蛍光ナノダイヤモンド滞留を成功させている。この滞留現象をより詳細に調べたところ、表面電荷の影響で滞留の程度が大きく変わることが明らかとなった。ナノ粒子の滞留と毒性などの関係についても詳細に検討し、ナノ粒子の表面電荷が線虫のナノ粒子取り込み機能に対して与える影響を解明した（論文執筆中）。本研究の目的である温度測定にとって、最適なナノ粒子ラベリング条件を決定する上で重要な知見である。
③線虫のカルシウムイメージング：本研究では、線虫の局部精密加熱と神経活動の相関を得ることを目指している。神経活動の測定のために、カルシウム指示性のあるGCaMPを発現した遺伝子組換え線虫の実験を開始した。複数の遺伝子組換え株を導入しているが、株によって培養条件が若干異なるため、カルシウムイメージングを実施するに当たっての条件検討を重ねている。
④オミクス解析への検討：本研究では、局所温度刺激を加えた際に生じる線虫のオミクス解析を行う。そのために、代謝物測定（メタボロミクス）に着目し、質量分析による測定を行うことに決定した。国際共同研究によるパートナーを見つけ、次年度測定する段階まで到達した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今年度は4年間の3年目終了中間地点であったが、これまでの研究で、蛍光ナノダイヤモンド温度測定の広視野化に成功しており、線虫の局所レーザー加熱も同時にできるようになった。カルシウムイメージングシステムについても条件検討を積み重ねている。次年度には、精密な局所温度刺激を加えた上で、神経細胞群の興奮を測定することが可能になると十分考えられる。今年度の論文発表でも、Lab on a Chip誌という重要雑誌に成果が発表されている。代表者以外にも、筆頭著者の学生が招待講演に呼ばれるなど非常に注目されている。論文発表数自体は1本であったが、次年度に論文発表できるまでのデータ蓄積を複数件できており、大きな収穫となっている。最終年度である次年度に向けて、研究は順調な進展を見せている。

今後の研究の推進方策

最終年度となる本年度は次の5点について研究・開発を実施する。①広視野・３次元・高速化技術の実装：これまでの研究で、焦点自動追尾を行いながら温度測定する技術を構築できている。今年度は、さらに精度を保った上での時間分解能を30秒程度まで短縮する。②カルシウムイメージング技術：昨年度、カルシウムイメージング用のトランスジェニック線虫を用いて、カルシウムイメージングの条件検討を行ってきた。温度測定、熱刺激、カルシウムイメージングの同時実施の際の条件検討が完了していないため、これらを引き続き検討する。また、本測定に特化した顕微鏡ステージトップインキュベーターが必要なため自作で構築する。③局所加熱技術の構築：線虫に対して任意の場所をレーザー刺激する事のできるシステムをすでに構築している。今年度は、このレーザー強度と温度上昇の関係を決定し、それをもとに線虫への精密温度刺激を行う。④神経細胞の温度感受性に関する研究:上記3つの項目を統合し、生きた線虫を精密に局所温度刺激し、その神経応答を観察し、その動態を解析する。⑤局所加熱に対するオミクス解析:上記技術で局所温度刺激した線虫体内の変化を、質量分析法を用いて解析する。これにより、温度と代謝の関係を細胞レベルで捉えるとともに、線虫における神経系の興奮の有無での代謝機能変化などを調べ、新しい視点の生物学研究に取り組む。

研究成果

• [国際共同研究] Humboldt University of Berlin/Institute of Physics/Prof. Oliver Benson(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: Humboldt University of Berlin/Institute of Physics/Prof. Oliver Benson
• [国際共同研究] Maastricht University/M4i/Prof. Ron Heeren(オランダ)
  • 国名: オランダ
  • 外国機関名: Maastricht University/M4i/Prof. Ron Heeren
• [国際共同研究] Strathclyde University/Department of Physics/Dr. Brian Patton(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: Strathclyde University/Department of Physics/Dr. Brian Patton
• [雑誌論文] Avoidance behavior and experience-dependent tolerance in response to bitter compounds in Caenorhabditis elegans (2023)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa S, Iida C, Takezawa Y, Chiba K, Kage-Nakadai E.
  • 雑誌名: Biosci Biotechnol Biochem. 巻: 87 ページ: 314-319
  • DOI: 10.1093/bbb/zbac200.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Glass-patternable notch-shaped microwave architecture for on-chip spin detection in biological samples (2022)
  • 著者名/発表者名: Keisuke Oshimi, Yushi Nishimura, Tsutomu Matsubara, Masuaki Tanaka, Eiji Shikoh, Li Zhao, Yajuan Zou, Naoki Komatsu, Yuta Ikado, Yuka Takezawa, Eriko Kage-Nakadai, Yumi Izutsu, Katsutoshi Yoshizato, Saho Morita, Masato Tokunaga, Hiroshi Yukawa, Yoshinobu Baba, Yoshio Teki, and Masazumi Fujiwara
  • 雑誌名: Lab on a Chip 巻: 22 ページ: 2519-2530
  • DOI: 10.1039/D2LC00112H
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Nitric Oxide Derived from Cytoglobin-Deficient Hepatic Stellate Cells Causes Suppression of Cytochrome c Oxidase Activity in Hepatocytes (2022)
  • 著者名/発表者名: Yoshinori Okina, Misako Sato-Matsubara, Yasutoshi Kido, Hayato Urushima, Atsuko Daikoku, Chiho Kadono, Yu Nakagama, Yuko Nitahara, Truong Huu Hoang, Le Thi Thanh Thuy, Tsutomu Matsubara, Naoko Ohtani, Kazuo Ikeda, Katsutoshi Yoshizato, and Norifumi Kawada
  • 雑誌名: Antioxidants & Redox Signaling 巻: 38 ページ: 463-479
  • DOI: 10.1089/ars.2021.0279
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 温度計としての実装に向けたダイヤモンド量子センサの周辺技術 (2022)
  • 著者名/発表者名: 藤原正澄
  • 学会等名: 量子生命科学会第4回大会
  • 招待講演
• [学会発表] Tailoring protein corona formation on polyglycerol functionalized nanodiamonds for precision quantum sensing (2022)
  • 著者名/発表者名: Zou Yajuan , Fujiwara Masazumi , Komatsu Naoki
  • 学会等名: 量子生命科学会第4回大会
• [学会発表] Glass-patternable notch-shaped microwave architecture for on-chip spin detection in biological samples (2022)
  • 著者名/発表者名: 押味 佳裕，?村 勇姿，松原 勤，?中 益明，仕幸 英治，Li Zhao，Yajuan Zou，?松 直樹，井? 勇太，?澤 有華，中台（??）枝??，井筒 ゆみ，吉? 勝利，森? 紗布，徳永 真登，湯川 博，?場 嘉信，?? 芳男，藤原 正澄
  • 学会等名: 量子生命科学会第4回大会
• [学会発表] マイクロ波アンテナの設計と生体内ダイヤモンドODMR信号定量予測 (2022)
  • 著者名/発表者名: 押味佳裕1，藤原正澄
  • 学会等名: 応用物理学会
• [学会発表] 生体内リアルタイム温度計測のためのWide-field 蛍光顕微鏡の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 井門 勇太，押味 佳裕，Yajuan Zou，藤原 正澄
  • 学会等名: 応用物理学会
• [学会発表] ナノダイヤモンドによる量子温度測定とその応用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 藤原正澄
  • 学会等名: センサ＆アクチュエータ技術シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] 温度計としての実装に向けたナノダイヤモンド量子センサの技術開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 藤原正澄
  • 学会等名: ハイブリッド量子ナノ技術委員会 第8回研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 量子センサを利用したバイオ分析チップデバイスの開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 藤原正澄
  • 学会等名: 固体量子センサ研究会 第３回研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 蛍光ナノダイヤモンドの光検出磁気共鳴分光法を土台にした生体試料センシング (2022)
  • 著者名/発表者名: 藤原正澄
  • 学会等名: 日本分光学会 2022年度北海道支部シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] ナノダイヤモンド温度計測への応用を目指した3 次元マイクロ波共振器の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 中島大夢，押味佳裕，藤原正澄
  • 学会等名: 応用物理学会春季学術講演会
• [学会発表] 生体内リアルタイム温度計測のための高速温度計測技術の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 井門 勇太, 押味 佳裕, 藤原 正澄
  • 学会等名: 応用物理学会春季学術講演会
• [学会発表] ナノダイヤモンド量子センサの開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 藤原正澄
  • 学会等名: 2022 JAIST International Symposium of Nanomaterials and Devices Research Area
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Plasticity in taste preference to bitterness and astringency requires DAF-16/FOXO in the AIY interneurons in Caenorhabditis elegans (2022)
  • 著者名/発表者名: Seiryu Ishikawa, Yuka Takezawa, Chiharu Iida, Yuko Yamada, Mohammad Shaokat Ali, Simo Sun, Eriko Kage-Nakadai
  • 学会等名: 22nd IUNS-ICN
  • 国際学会
• [学会発表] Plasticity in taste preference to Epigallocatechin gallate requires DAF-16/FOXO in the AIY interneurons in Caenorhabditis elegans (2022)
  • 著者名/発表者名: Seiryu Ishikawa, Yuka Takezawa, Chiharu Iida, Yuko Yamada, Mohammad Shaokat Ali, Simo Sun, Eriko Kage-Nakadai
  • 学会等名: 第45回日本分子生物学会年会
• [備考] 岡山大学ナノ化学研究室ホームページ
  • URL: https://www.nanochem-okayama-u.net/