研究課題
細胞内の生化学反応の制御に生体高分子を含む液-液相分離が形成する「液滴」が重要な役割を果たすことが明らかになってきた。液滴はまた相変化により、神経変性疾患に伴うタンパク質線維(アミロイド)を形成する場合があることも分かってきた。液滴形成の解明は細胞内の数十nmオーダー空間分解能での物性力学値（温度、pH、粘度、圧力・剪断力、物質濃度等）を計測する必要がある。本研究では、代表者らが開発してきたIn-cell NMR、レオロジーNMR（RheoNMR）、ナノ量子センサーなどの計測技術を用いることで、液滴形成と維持、相変化における物性値を明らかにする手法を開発することを目指した。アミロイド様繊維を形成するタンパク質としてSOD1をとりあげた。SOD1は、細胞内で相転移を経て、アミロイド筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症に関与するタンパク質線維(アミロイド)を形成する。溶液NMR法を用いて、タンパク質夾雑物（crowder）が大量に存在する混雑環境を模倣しSOD1の高次構造の変化や動的な構造特性の変化をアミノ酸レベルで解析した。解析には剪断力が掛かった状態でリアルタイムで測定できるRheoNMRも使用した。流体力学的ストレスによるSOD1の高次構造の変化や、動的な構造特性の変化をアミノ酸レベルかつリアルタイムで追跡し、アミロイドの核形成に関わる部位や線維の中核となる部位を特定することに成功した。また混雑環境は高次構造に大きな影響を与えない一方、アミロイド先駆体や阻害体との化学平衡に影響を及ぼすことが分かった。
2: おおむね順調に進展している
先行研究でATPはタンパク質凝集を阻害する効果があることが示されたが(Patel Science 2017)、詳細なメカニズムは分かっていなかった。我々の研究では溶液NMR法を用いて、三種類の細胞内タンパク質(ユビキチン、p62、α-シヌクレイン)とATPとの相互作用を調べたところ、ATPはタンパク質の種類によらず、タンパク質の二次構造を形成していない柔軟な構造領域を中心に非特異的に弱く結合することがわかった。興味深いことに、この相互作用がタンパク質の水和状態を変化させ、凝集しにくくなることが示唆された。細胞内環境を模倣した条件下で、観察対象の立体構造のみならず動的構造特性を原子レベルで解析する手法を確立し、本研究は順調に進行していると言える。更に神経変性疾患においてアミロイド形性をする病因性タンパク質としては、パーキンソン病と関与するα-synucleinの呈するLLPS(液胞形性)についても順調に研究を進めている。α-synucleinについてはユビキチン化とSUMO化による液胞化への影響も興味の対象として試料調製を進めつつある。ナノ量子センサーの開発については、ODMR計測によりin vitro精製タンパク質系において液的内ナノ環境計測を実施し、LLPSにより形成した液滴の物理・化学パラメータの取得を進めた。さらに感度の向上を目指して、機械学習を用いた計測の最適化を行った。またナノダイヤモンドに対するNVセンター形跡効率の向上開発などを進めた。核内への導入に適した5ナノメートルサイズのナノダイヤモンドの調整等、細胞内ターゲッティングのための技術開発も進行している。
本研究によってODMRの装置、計測手法、得られたデータ解釈などに相当量の進捗が見られた。それらを用いて相転移により液滴形成する系の物性・力学パラメーターを高空間分解能高精度での測定に取り掛かる。まずは閉じたin vitro系での現象観察をし、続いて細胞内での液滴形成について、測定する。この際、鍵となる技術は、ナノダイアモンド粒子の生体高分子への標識と試料の生細胞へのターゲッティングであろう。これらの手法開発をα-synuclein,fus,dCAS9等を用いて進める。ODMR計測については、計測技術の高感度化を進めるとともに、液滴のナノ環境計測の取得の結果から、精製タンパク質系におけるLCドメインの液滴形成メカニズムを明らかにする。また、ストレス顆粒の形成を細胞内での生命現象と紐付けるため、培養細胞系における極微量生体分子の検出技術の開発を進める。本研究で細胞内混雑環境におけるタンパク質の相転移の知見が得られた。今後は、より難易度の高い「その場」でのタンパク質の相転移の解析に取り組む。具体的にはRheo-NMRやin-cell NMRなど過渡的な状態を原子レベルで捉えれることができる手法を使い、どのようにタンパク質が生細胞内で相転移を引き起こすのか調べる。本研究では、試験管内において、ATPのタンパク質凝集阻害能のメカニズムを原子レベルで解析することができた。今後は混雑環境や流体力学的ストレスのある環境といった細胞内環境の「その場」におけるATPとタンパク質との相互作用を解析し、真のATPによるタンパク質凝集抑制効果を評価する。
すべて 2021
すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 1件)
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