| 研究課題/領域番号 |
20H00478
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
重信 秀治 基礎生物学研究所, 新規モデル生物開発センター, 教授 (30399555)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 共生 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
半翅目昆虫アブラムシとその細胞内共生細菌ブフネラはお互い相手なしでは生存が不可能なほど緊密な相互依存関係にあり、共生研究のモデル系として100年以上もの研究の歴史を有している。しかし、アブラムシにはRNAiが効きにくいなど、効果的な遺伝子機能解析の技術がなかったため、これまで実証的な研究が不可能であった。私たちは最近、アブラムシにおいてCRISPR/Cas9ゲノム編集の技術を確立することに成功した。本研究ではこのゲノム編集技術を最大限に活用し、アブラムシの「共生遺伝子」を同定し、その機能を明らかにすることを目標とする。
これまでに共生器官のトランスクリプトーム解析等を通して、「共生遺伝子」の有力候補を多数リストにしていた。今年度はCRISPR/Cas9 NHEJ (non-homologous end joining) により候補遺伝子のうち３つの遺伝子に注目してノックアウトを試みた。いずれの遺伝子においても高い効率でG0世代のノックアウトに成功し、さらに全てにおいて生殖系列に変異が導入され、変異系統を複数確立することができた。中でも遺伝子Xのノックアウトでは共生細菌ブフネラが消失する表現型が観察され、この遺伝子はブフネラとの共生に必須の共生遺伝子であると結論された。
これまでの共生遺伝子の探索はタンパク質をコードする遺伝子のみをターゲットにしてきた。そこで新規の共生遺伝子の探索するために、RNA-seqデータを用いて共生器官に発現するnon-coding RNAの予測を行った。
すでにCRISPR/Cas9ゲノム編集によるNHEJを介したノックアウトの技術を確立したが、これを基礎にしてゲノム編集のさらなる高度化を進めた。具体的にはノックイン技術の開発を行っている。また、これまで未知であったアブラムシ細胞内で動くプロモータ配列の同定に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
遺伝子Xのノックアウト実験では、ノックアウトによるブフネラとの共生が破綻するという期待通りの表現型を得ることができた。これはアブラムシの機能解析における画期的な成果であると言える。ゲノム編集技術の高度化についても、ノックインはまだ成功していないものの、プロモータの同定やtransientな強制発現には成功しており、本基盤研究1年目としては計画以上の進展であった。また、今年度新たに当研究室に加わったメンバーの貢献もあり、non-coding gene の解析が計画よりも早く進展した。また、共生器官に特異的に発現するBCRペプチドの機能を解析した論文 (Uchi et al., 2019) がMicrobes and environments 誌の年間ベスト論文に選ばれ表彰された。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究1:ゲノム編集による「共生遺伝子」候補の機能解析：私たちはすでに共生器官のトランスクリプトーム解析等を通して「共生遺伝子」の有力候補を多数リストにしている。本研究ではゲノム編集を用いてこれらの遺伝子をノックアウトして、ブフネラとの共生に与える影響を調べる。表現型として以下をリードアウトとして、共生に対する影響を評価する。i. ブフネラの数や形態。ii. アブラムシの成長に対する影響。iii. 共生器官の遺伝子発現及び形態。今年度遺伝子Xで明確な表現型が観察されたので、今年度はさらに多角的に表現型を解析するとともに、新たな変異体の作出も進める。
研究2:新規の「共生遺伝子」・「共生因子」の探索(特にnon-coding)：研究1ではこれまでに申請者が蓄積してきたデータに基づいてすでにリストにある共生遺伝子候補を解析対象としたが、研究2では新しいゲノミクスのデータや手法を用いて、新規に「共生遺伝子」や「共生因子」を探索する。中でもnon-codingの因子に注目する。昨年度、RNA-seqデータに基づいてlong non-coding RNA (lnc RNA)の網羅的探索のパイプラインを構築し、多数のlnc RNAの同定に成功した。今季はこれらのデータを整理して論文化するとともにそれらの機能解析を進める。さらに、比較ゲノムによる制御配列の同定も試みる。
研究3:ゲノム編集技術の高度化：私たちはすでにアブラムシでCRISPR/Cas9ゲノム編集によるNHEJ (non-homologous end joining) を介した高効率ノックアウトの技術を確立している。これを基礎にしてゲノム編集のさらなる高度化を進める。昨年度、アブラムシ細胞内で活性のあるプロモーターの同定に成功したためこれとゲノム編集の技術を組み合わせて、ノックイン技術の開発を進める。
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