| 研究課題/領域番号 |
20H01614
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
丸山 伸之 京都大学, 農学研究科, 教授 (90303908)
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| 研究分担者 |
福冨 友馬 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 診断・治療薬開発研究室, 室長 (30463110)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | アレルゲン / 甲殻類 / 構造 / エピトープ / 抗体 |
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| 研究実績の概要 |
甲殻類に対するアレルギーを示す患者血清を約40名収集するとともに、患者血清に対する甲殻類への特異的IgE抗体価測定と問診により臨床データを整備し、本研究に用いる血清の準備を完了した。収集した患者血清中の精製アレルゲンに対する特異的なIgE抗体と、甲殻類アレルギーの臨床像を解析するために、エビのアレルゲンの調製を行った。それらをコードする遺伝子を合成し、発現ベクターを構築して、組換えタンパク質の調製を試みた。Tropomyosin、arginine kinase、myosin light chain 2 sarcoplasmic calcium binding protein、troponin C、ヘモシアニンなどの主要なアレルゲンについて大腸菌発現系を構築し、目的のアレルゲンを発現させた。発現を確認後、必要に応じて硫安分画を行い、組換えタンパク質に付加したタグに対するアフィニティーを利用した精製に加え、ゲルろ過/イオン交換クロマトグラフィーなどを行うことにより、計画したすべてのエビに対するアレルゲンを精製した。精製した各アレルゲンに対する特異的IgE抗体価を測定した。解析したアレルゲンの中でtropomyosin、arginine kinaseに対する感作率が高い傾向であった。高次構造がIgE抗体との結合に影響する可能性があるため、今後、調製したアレルゲンの構造評価や酵母の発現系によるアレルゲンの調製などを行い、甲殻類に対するアレルギーを示す患者におけるアレルゲンの感作プロファイルを完成させる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. 甲殻類アレルギー患者の血清の収集と評価
研究分担者の医療機関を受診した患者の中で甲殻類に対するアレルギーと考えられる患者に対し、特異的IgE抗体測定と問診により甲殻類での交差の状況について解析した。
2. 甲殻類アレルゲンコンポーネントの調製
エビに対するコンポーネントについては組換えタンパク質の調製を試みた。Tropomyosin、arginine kinase、myosin light chain 2、sarcoplasmic calcium binding protein、troponin C、ヘモシアニンについて大腸菌発現系を構築した。pET、pGEX、pMALなどの発現ベクターのうちいずれかのベクターによって、目的のアレルゲンが可溶性として発現した。タグに対するアフィニティーによる精製などを用いて、すべてのアレルゲンの精製を行った。精製効率の低いものもあったが、クロマトグラフィーの条件を検討することにより使用しうる純度の組換えタンパク質を調製した。大腸菌発現系の場合に可溶性であっても構造形成の点で問題がある場合があるため、酵母による発現系の作製についても進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
酵素標識したヒトIgE抗体に対するモノクローナル抗体と蛍光基質を用いた酵素結合免疫吸着法により、甲殻類に対してアレルギー症状を示す患者血清を用いて、精製したエビアレルゲンに対するIgE抗体の定量的に解析し、顕著に検出されるアレルゲンを明らかにする。特に、酵母による発現系を構築しつつあるものについて、調製できるものは本評価に加える。患者血清についても、追加で収集できたものを加え、甲殻類に対するアレルギーを示す患者におけるアレルゲンの感作プロファイルを完成させる予定である。
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