| 研究課題/領域番号 |
20H02532
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
養王田 正文 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 卓越教授 (50250105)
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| 研究分担者 |
前橋 兼三 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (40229323)
福谷 洋介 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (50747136)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 嗅覚受容体 / 匂いセンサー / グラフェン / 無細胞タンパク質合成 |
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| 研究実績の概要 |
嗅覚受容体のコムギ胚芽無細胞系による発現が可能であることは確認されていたが、発現した嗅覚受容体が機能を有するかは不明であった。従来のリガンド応答解析法はin vitroで発現・精製した嗅覚受容体の機能解析には利用できないので、リガンドと結合して活性化した嗅覚受容体がGタンパク質と結合することを利用した新しい解析方法を開発し、検証に利用した。リガンド既知の高発現嗅覚受容体であるhOR52を、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムでリポソーム上に発現させた。Western BlottingによりhOR52のリポソーム膜上の発現を確認した。hOR52を発現したリポソームとGFP融合単量体Gタンパク質αサブユニット(GFP-min-Golf)を混合し、hOR52のアゴニストであるノナン酸を添加した。インキュベーション後、Western Blottingにより、リポソーム画分に含まれるGFP-mini-Golf量を評価した。その結果、ノナン酸濃度依存的にリポソーム画分に含まれるGFP-min-Golfが増加することを確認した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、hOR52がGFP-min-Golfと複合体を形成することも確認した。この結果から、in vitroで発現した嗅覚受容体がリガンド結合能を有することが確認された。さらに、hOR52以外の嗅覚受容体もin vitroで発現、精製が可能であることを確認している。hOR52をグラフェン電界効果トランジスタに吸着させて作成したhOR52修飾グラフェン電界効果トランジスタがノナン酸を電気的に検出することを確認した。10 nMから線形的な濃度依存性があり、匂いセンサーとしての実用化が可能であることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究を進める上で最も重要な課題であった、嗅覚受容体の機能的発現とグラフェン電界効果トランジスタによるリガンド応答検出が可能であることを明らかにした。既に10 nMから0.1mMまで線形的な濃度依存性が得られており、細胞を用いた方法よりも高感度であることから、実用的な匂いセンサーの開発が可能であることが示唆されている。この結果から、研究開発を予定通り進めることが可能であることが分かった。
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| 今後の研究の推進方策 |
hOR52以外の嗅覚受容体でも、機能的発現とグラフェンへの固定化、リガンド応答検出が可能かを検証する。細胞での機能的発現にRTP1Sを必要とする嗅覚受容体はin vitroでの発現も難しい可能性がある。その場合には、in vitroでのRTP1Sの共発現も検討する。また、グラフェン電界効果トランジスタへ物理的吸着する方法ではセンサーとしての安定性に問題があるので、結合方法の開発を行う。具体的にはグラフェンに結合する特性を有するピレンを嗅覚受容体に結合させる方法を考える。さらに、種々の変異を導入した人工嗅覚受容体の開発を行う。
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