| 研究課題/領域番号 |
20H02583
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
荒磯 裕平 金沢大学, 保健学系, 助教 (20753726)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / タンパク質輸送 / TOM複合体 / 前駆体タンパク質 / 高速原子間力顕微鏡 / 膜透過装置 |
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| 研究実績の概要 |
界面活性剤条件下における三量体TOM複合体の高速原子間力顕微鏡（HS-AFM）解析を更に進め、構造変換機構の理解を深めた。HS-AFM解析では、三量体を構成する単量体チャネルの分子サイズが等価ではなく、非対称な会合状態をとっていることが示唆された。この非対称性は、二量体-三量体間の構造転換において重要な役割を担っている可能性がある。さらに、三量体を構成する各分子の最大の高さをそれぞれ0.2秒毎に60秒間測定しヒストグラムを作成したところ、三量体を構成する３つの単量体のうち１つが、他と比べて優位に大きいことが明らかになった。これらの解析結果から、三量体TOM複合体は正三角形型の対称的な複合体ではなく、安定な二量体と単量体が相互作用した（1+2）型の会合状態をとり、単量体が出入りすることで三量体-二量体間の構造変換が起こることが示唆された。
また、より生体内に近い状態での分子動態を解明するため、脂質二重膜ナノディスクに再構成したTOM複合体（TOM-ND複合体）のHS-AFM観察も並行して行った。その結果、界面活性剤を含まない溶液中で、脂質ナノディスクに覆われた三量体TOM複合体を観察することに成功し、今後のTOM複合体の動作解析のための基盤を構築することができた。
一方で、TOM-ND複合体の調製にはこれまでより高収量でTOM複合体を精製する必要があった。そこで我々はTOM複合体の発現株を改良し、TOM複合体を構成する６つのサブユニットすべての5’領域に過剰発現プロモーターを導入し、TOM複合体の過剰発現株を構築した。その結果、精製量の大幅な改善が認められ、これまでと同様に三量体、二量体TOM複合体のイメージングすることも可能であった。今後は過剰発現株を用いて解析を行うことで、これまでよりも高効率で迅速に構造解析を進めることが可能となり、研究のさらなる発展が期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
TOM複合体単独でのHS-AFM観察が順調に進んだ。複数種類のデータセットを取得し、統計的なデータ解析・評価によってTOM複合体の分子動態を解析することができている。今後はタンパク質取り込みの可視化へ進むことが可能である。ここまでの研究成果については、2021年度中に複数回、学会発表を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
新たに構築したTOM複合体過剰発現株から高収量でTOM複合体を精製し、下記２点について重点的に解析を進めることで、TOM複合体の動作する様子を可視化・理解する。
[1] 各サブユニットの空間位置決定
受容体サブユニットTom20や補助サブユニットTom5の可溶性領域にHS-AFM観察で視認しやすいタグ配列を導入し、タグを目印に各サブユニットの位置を決定する。空間配置を決定することで、構造変換やタンパク質取り込みにおける各サブユニットの役割を明確にすることができる。
[2] 基質タンパク質取り込みの可視化
様々な基質タンパク質を大腸菌発現系によって精製し、HS-AFM中のTOM複合体に添加することでタンパク質取り込み機構を可視化する。TOM複合体を再構成したプロテオリポソームを用いた生化学解析によって予備的なスクリーニングを行い、観察に適した基質を選定する。
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