| 研究課題/領域番号 |
20H02594
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
オケヨ ケネディオモンディ 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 講師 (10634652)
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| 研究分担者 |
小穴 英廣 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 准教授 (20314172)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 血液脳関門 / 選択的物質輸送 / 血管内皮細胞 / マイクロメッシュ培養法 / 経上皮電気抵抗 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，血液脳関門（blood-brain barrier, BBB）の構成細胞が直接的に相互作用しうるモデルを作製することにより生体内の血液脳関門のバリア機構を厳密に捉えたin vitroモデルを実現し，血液脳関門の選択的物質輸送のメカニズム解明を目指す．
本年度は，独自技術である「マイクロメッシュ培養法」を駆使し，強固な密着結合を有する血管内皮細胞シートを作製し，そのバリア能を評価することを目指した．本法では，線幅が細く，開口部が広いことが特徴のメッシュ構造基板を用いて細胞－基板間接着を制限することにより，細胞間結合による細胞シート形成が誘導される．
本実験では，血管内皮細胞の異種であるヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）やbrain microvascular endothelial cell line (hCMEC/D3)をメッシュ構造基板上に播種したところ，個々の細胞が自己組織化的にメッシュの隙間を埋め，5日間で均一なシートを形成した．また，経上皮電気抵抗（TEER）の計測により細胞間結合に由来するバリア能を経時的に評価した結果，シート形成過程および形成後のそれぞれの段階でTEER値の上昇が確認され，細胞シート形成とともに細胞間結合が強化されることが示唆された．さらに，播種から14日後に行った免疫染色により密着結合を担うOccludinやZO-1等のタンパク質の発現が確認された．なお，従来の多孔質膜上で得られた細胞レイヤーと比較し，本法で得られた細胞シートの方がTEER値が高いことも認められた．
今後，血管内皮細胞シート上に直接周皮細胞を播種することで血管細胞と周皮細胞の共培養モデルを作製し，さらにマトリゲル包埋培養されたアストロサイトと組み合わせることで3次元共培養モデルを完成させ，構成細胞同士の物理的コンタクトの有無やそのバリア能への影響を調べる．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究で目指している血液脳関門モデルの実現において最も重要である血管内皮細胞の細胞シートの作製法が確立し，形成された細胞シートのバリア能も想定以上に良いことから，3次元モデルの実現が確実となったことが主な理由である．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後，血管内皮細胞シート上に直接周皮細胞を播種することで血管細胞と周皮細胞の共培養モデルを作製し，さらにマトリゲル包埋培養されたアストロサイトと組み合わせることで3次元共培養モデルを完成させ，構成細胞同士の物理的コンタクトの有無やそのバリア能への影響を調べる．また，実現する3次元共培養モデルをマイクロ流体デバイスに組み込み，せん断流れのよる刺激付与が可能な動的モデルを実現した上で，物質通過による本モデルの機能性評価も行う予定である．
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