機能性小分子・タンパク質ペアを利用したがん蛍光イメージングの新手法

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20H02874
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 小嶋 良輔 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (10808059)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 蛍光プローブ / がん / 蛍光イメージング / 機能性小分子 / 機能性タンパク質

研究実績の概要

本研究課題において、我々は、機能性小分子と機能性タンパク質を協奏的に利用する独自のアプローチをとることで、①がん表面の抗原に結合して迅速かつ大きなactivationを示す蛍光プローブ ② bioorthogonalな蛍光プローブとレポーター酵素のペアを利用した、新規がん蛍光イメージング法 を開発することを目指している。
①に関して、我々は、昨年度までにモデル抗原であるGFPに結合するだけで10倍以上の蛍光上昇を示すプローブの創製に成功すると共に、質の高いタンパク質-小分子蛍光団のハイブリッドプローブを作る反応条件の最適化を進めてきた。本年度は、これまでに得た知見を利用して、がん表面抗原として知られるEpcamを認識して大きなシグナルの増強を示す蛍光プローブのスクリーニング・開発を新たに進め、Epcamに結合するだけで7倍以上の蛍光上昇を示すプローブの開発に成功すると共に、これが生細胞でのイメージング系に適用可能であることを明らかにした。
②に関して、我々は昨年度までに、D-Fucoseを有する蛍光団と、メタゲノム由来のグリコシダーゼTd2F2をbioorthogonalなプローブ・酵素ペアとして確立し、このペアのがんイメージングに対する有用性を示してきた。本年度は、Td2F2の活性を一細胞レベルでモニタリングすることが可能なプローブSPiDER-D-Fucを新たに開発し、これを用いてTd2F2のdirected evolutionを行うことで、がんイメージングにより適した特性を持つようにTd2F2を改変することを目指した。結果、野生型の酵素と比較して、大幅に活性が上昇した変異体や、酸性環境で活性が顕著に上昇する変異体を取得することに成功した。さらに、培養細胞系において、取得した変異体を利用することで、より鮮明ながん細胞イメージングを可能になることを見出した。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

プロジェクト①に関しては、予定していたプローブ開発が進み、対象抗原も拡張することができたため、本研究で採用した抗原を認識して初めて光るプローブの設計法の汎用性をしめすことができたと考えており、おおむね順調に進捗していると言える。
プロジェクト②に関しては、Td2F2のdirected evolutionの系が想定していたよりも効果的に働き、野生型と比較して10倍以上の活性を持つ強力な変異体を取得できた他、特殊な進化系をデザインしなくても、目的のpH感受性を示す変異体を得ることが可能であったなど、予想以上の結果を得ることができた。実際に取得した変異体の有用性も培養細胞レベルで確認できている他、取得した変異体の活性に関する構造的な観点からの検討も進められており、当初の予定以上に進行していると言える。このことから、該当の評価とした。

今後の研究の推進方策

プロジェクト①に関しては、取得したプローブを利用して、がん細胞のイメージングを引き続き試みる。これにあたり、調製したプローブに関して、一部の抗体ミメティックがダイマーを形成し、このプローブが消光を受けないためにバックグラウンド蛍光になることが現在示唆されており、このようなフォームを除くようなプローブ調製をすることで、より高いコントラストでのイメージングが可能になると考えている。また、対象抗原の拡張にも引き続きトライすると共に、構造生物学的手法を用いたprobeのactivation原理の 解明なども目指したい。
プロジェクト②に関しては、開発したプローブ・酵素ペアを利用して、培養細胞・in vivoの両系において、鮮明ながんイメージングが可能であることを示したい。さらに、プローブ側の構造も最適化することでより速い酵素反応を起こすことができる可能性が示唆されており、このような観点からのプローブ構造の最適化も試みたい。

研究成果

• [雑誌論文] Development of a fluorescent probe library enabling efficient screening of tumour-imaging probes based on discovery of biomarker enzymatic activities (2022)
  • 著者名/発表者名: Yugo Kuriki, Takafusa Yoshioka, Mako Kamiya, Toru Komatsu, Hiroyuki Takamaru, Kyohhei Fujita, Hirohisa Iwaki, Aika Nanjo, Yuki Akagi, Kohei Takeshita, Haruaki Hino, Rumi Hino, Ryosuke Kojima, Tasuku Ueno, Kenjiro Hanaoka, Seiichiro Abe, Yutaka Saito, Jun Nakajima, Yasuteru Urano
  • 雑誌名: Chemical Science 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1039/D1SC06889J
  • 査読あり
• [雑誌論文] Photoactivatable fluorophores for durable labelling of individual cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Hiroki Kashima, Mako Kamiya, Fumiaki Obata, Ryosuke Kojima, Shotaro Nakano, Masayuki Miura, Yasuteru Urano
  • 雑誌名: Chemical Communications 巻: 57 ページ: 5802-5805
  • DOI: 10.1039/D1CC01488A
  • 査読あり
• [雑誌論文] Intracellular Unnatural Catalysis Enabled by an Artificial Metalloenzyme (2021)
  • 著者名/発表者名: Yasunori Okamoto, Ryosuke Kojima
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology 巻: 2312 ページ: 287-300
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-1441-9_17
  • 査読あり
• [学会発表] 機能性タンパク質・小分子の協奏利用による新規がん蛍光イメージング技術の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 小嶋良輔、中館眞美子、王子儀、浦野泰照
  • 学会等名: 日本薬学会第142年会
• [学会発表] 生体直交性を有する蛍光プローブ・改変酵素ペアを用いた新規がんイメージング手法の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 王子儀、小嶋良輔、浦野泰照
  • 学会等名: 日本薬学会第142年会
• [学会発表] 新たな先端医療創製を目指したものづくり ～機能性小分子の開発から、細胞機能の自在プログラミングまで～ (2021)
  • 著者名/発表者名: 小嶋良輔
  • 学会等名: MPUFセミナー
  • 招待講演
• [学会発表] 抗原結合を検知する新規activatable型蛍光プローブの開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 中館眞美子、小嶋良輔、浦野泰照
  • 学会等名: 日本ケミカルバイオロジー学会 第15回年会
• [図書] Methods in Molecular Biology, Mammalian Cell Engineering (2021)
  • 著者名/発表者名: Ryosuke Kojima
  • 総ページ数: 330
  • 出版者: Springer Nature
  • ISBN: 978-1-0716-1441-9
• [産業財産権] 特殊な活性を持つβ-Glucosidase Td2F2の変異体 (2022)
  • 発明者名: 小嶋良輔・王子儀・浦野泰照
  • 権利者名: 小嶋良輔・王子儀・浦野泰照
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 63/313747 (米国仮出願）
  • 外国