| 研究実績の概要 |
我々は、これまでの研究で、GLUT4の膜外ループに結合しているN型糖鎖が、インスリン刺激時にGLUT4を細胞膜に引き留める役割を果たしていることを明らかにしてきた。一方、この糖鎖の細胞内における役割については未だ不明な点が残されている。本研究では、細胞内と細胞表層に存在するGLUT4をそれぞれ識別してラベル化できるPYPタグプローブを開発し、糖鎖の細胞内での役割の解明に取り組んだ。PYPタグのリガンドは、桂皮酸・クマリン誘導体が知られているが、非天然構造を持つPCAFリガンドをこれまでに見出している。このリガンドに各種蛍光色素ATTO488, TAMRA, SiR650, およびSiR700を連結したプローブPCAFgreen, PCAForange, PCAFred, およびPCAFfarredをそれぞれ開発したところ、PCAFgreenは、細胞膜非透過性で、細胞表層タンパク質と選択的に反応し、それ以外のプローブは興味深いことに細胞表層膜タンパク質と反応することなく、細胞内タンパク質と選択的に結合することが分かった。これらの性質を利用して、PYPタグを介して細胞表層と細胞内部のGLUT4をそれぞれ別の色の蛍光色素で識別してラベル化することに成功した。この技術を利用して、GLUT4の動態を調べたところ、細胞表層に出ることのできるGLUT4と細胞内部に留まり続けているGLUT4が細胞に併存し、さらに、糖鎖を欠損させると、細胞内部に留まっているGLUT4は、リソソームに運ばれるていることを可視化することができた。このように、異なる動的性質を持つタンパク質を動的性質に応じて識別することのできる技術の開発に成功するとともに、GLUT4の糖鎖が細胞内で果たす役割の知見を得ることができた。
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