| 研究課題/領域番号 |
20H02893
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
吹谷 智 北海道大学, 農学研究院, 教授 (10370157)
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| 研究分担者 |
後藤 恭宏 九州大学, 医学研究院, 助教 (20558358)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ビフィズス菌 / トランスクリプトーム / 腸内細菌叢 / RNA-Seq / 選択的回収 |
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| 研究実績の概要 |
1. 表層提示タグ発現Bifidobacterium longum 105-A株の回収方法の検討
令和2年度に構築し，細胞表層へのペプチドタグの提示が確認された4種類の表層タグ発現株について，それぞれ単独での培養を行い，タグ提示細胞の回収方法の検討と回収率の評価を進めた．Strep-tagII発現株については，Strep-tagIIと特異的に結合する分子であるStrep-tactinが付加された磁気ビーズを用いて回収を行った．FLAG, HA, Mycタグ発現株については，それぞれのタグに特異的なビオチン標識済み抗体を用いてタグに結合させ，ストレプトアビジンビーズを用いて回収を行った．これらの試験の結果，RNA Protect Reagentで処理したStrep-tagII発現株の回収率が最も高く，全細胞の40%を回収できることが明らかになった．一方他のペプチドタグを用いた場合の回収率は1～4%であった．これらの結果から，Strep-tagII発現株と磁気ビーズによる回収が腸内からの細胞回収に最も適していると判断した．
2. 1-kestose存在下での遺伝子発現プロファイルの取得
これまでの研究で，1-kestoseの摂取により105-A株の通常飼育マウス腸内への定着が達成されている．そこで腸内での遺伝子発現の比較対照として，1-kestose存在下での105-A株の遺伝子発現プロファイルの取得を行った．1% (w/v)のglucoseまたは1-kestose含有1/2 MRSCS培地で対数増殖期中期まで培養した105-A株菌体からRNAを抽出し，rRNAの除去を行いRNA-Seq解析に供した．RNA-Seq解析の結果，1-kestose存在下での遺伝子発現プロファイルが得られ，glucose存在下と比較して127個の遺伝子が有意に発現変動していることが明らかになった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和3年度も新型コロナウイルス感染症の影響により，研究活動が停滞する時期があったため，研究期間を延長したが，タグ発現株の回収方法の検討と評価方法の確立に時間を要したため，計画通りの進捗を達成することはできなかった．一方で今後の解析の基盤となるRNA-Seqの実験手法および解析手法を確立し，さらに1-kestose存在下での遺伝子発現プロファイルを得ることができた点は，課題達成に向けて重要な成果と言える．
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度の研究で細胞表層へのStrep-tagII発現株が細胞回収に最も適していることが明らかになった．次年度実際のマウス盲腸内細菌叢からの回収を試みるが，その前段階として，複数のヒト腸内細菌種を用いた人工腸内細菌叢を構築し，他の腸内細菌が共存する状態で表層タグ発現株の回収について評価することが必要であると考える．動物試験に比べて短期間で評価が可能であること，さらにin vitroでの評価であるため，回収前と回収後の遺伝子発現プロファイルの変化についても検証することができるため，この系を先にテストすることで動物試験での条件検討を極力減らすことができると考えられる．
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