| 研究課題/領域番号 |
20H02902
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
藥師 寿治 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (30324388)
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| 研究分担者 |
阿野 嘉孝 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (00403642)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 応用微生物 / 発酵 / バイオテクノロジー / 酵素 / 酢酸菌 |
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| 研究実績の概要 |
酢酸菌は，細胞表層に特徴的な物質酸化系を持ち，酢酸発酵やビタミンＣ生産におけるソルボース発酵などに利用されてきた。そこは，細胞の外とも内とも説明しづらいペリプラズム空間と呼ばれる細胞内区画である。細胞質での代謝に比べると，ペリプラズム空間での代謝は，①細胞質への取り込みや細胞質からの排出に関わる時間とエネルギーの抑制（高速物質変換），②毒性物質そのもの，あるいは毒性の中間体を経る代謝経路の構築（毒性物質生産），③代謝上不安定で短寿命な化合物の生産（短寿命物質生産），に優位に立つことができると考えられる。本研究の目的は，ペリプラズム空間での代謝が特徴的な酢酸菌で，上述した３つの観点の代謝経路の拡張を試みることである。
特に今年度は，一つ目の高速物質変換の検討を，キナ酸からのプロトカテク酸生産をモデル代謝系として検討した。キナ酸は酢酸菌が元来有しているペリプラズム空間の酸化系によってデヒドロキナ酸に変換される。これは，ペリプラズム空間へ分泌されるように分泌シグナルを遺伝子工学的に付加したデヒドロキナ酸脱水酵素（TAT-AroD）によってデヒドロシキミ酸へと脱水される。はじめに，TAT-AroDの細胞内局在に関する検討を行った。カルボキシ末端側に精製タグを付加した組換え体を利用して，TAT-AroDを精製し，アミノ末端のアミノ酸配列を決定したところ，分泌シグナルの切断を確認することができた。
さらにプラスミドを用いて土壌細菌由来のデヒドロシキミ酸脱水酵素を上述した組換え酢酸菌株に発現させ，キナ酸からプロトカテク酸を生産する菌株の構築を試みた。しかし，目的の組換え株を構築したものの，安定に培養させることはできなかった。今後，発現量を制御できるような発現方法の検討やプラスミドを用いない発現方法の検討を通して，この問題を克服する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では酢酸菌に見られるペリプラズム代謝を，次の三つの観点から拡張しようとするものである。①高速物質変換，②毒性物質生産，③短寿命物質生産。概要欄で述べたとおり，高速物質変換については問題を抱えながらも当初の想定以上に順調に進んでいる。
毒性物質生産については，1,3-プロパンジオールからのアクリル酸の生産を試みた。これについては他の研究グループから報告がなされており，昨年度は本研究で，その報告の確認をするにとどまった。確かに天然の酢酸菌によって，1,3-プロパンジオールが3-ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）に酸化され，さらに一部がアクリル酸に変換された。3-HPをアクリル酸に変換する脱水酵素の同定を試みたが，酵素活性の検出に難航し，現在までに芳しい展開には至っていない。生産されるアクリル酸を還元する酵素を用いることを考え，探索したが，そのような酵素を見いだすことはできていない。今後の課題としては脱水酵素の活性測定である。
三つ目の短寿命物質の生産については，コハク酸脱水素酵素の解析に着手したところで，ほとんど進展していないと言って良い。これは，他の研究グループの報告にしたがって，属の異なる酢酸菌由来の遺伝子を発現させることを第一のステップとしており，菌株の構築を進めている。
以上のように，三つの観点で進めているが，それぞれ進み方が異なっている。今後，いくつかの検討を重ねることにより，それぞれに抱えている問題を解消し，研究を前進させることができると期待している。今後の展開への見通しも含めて，「概ね順調」と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
三つの観点，①高速物質変換，②毒性物質生産，③短寿命物質生産のうち，①高速物質変換については，プロトカテク酸までのペリプラズミック代謝工学を完成させる。これをさらに展開して，プロトカテク酸からは脱炭酸酵素（AroYあるいはUbiDX）によってカテコールをペリプラズム空間で生産させる試みを行う。これら脱炭酸酵素はプレニル化FMNというユニークな補欠分子族を持つという特徴があり，ペリプラズム空間での発現は難航が予想されるが，積極的に挑戦したい。
②の毒性物質生産に関しては，引き続き，アクリル酸生産に向けた3-ヒドロキシプロピオン酸脱水酵素に関する解析を行う。また，上述したカテコールも毒性物質と言える。そこで，構築しようとしているペリプラズム生産系と比較するために，カテコール生産系を細胞質酵素でも構築する。この比較によって，毒性物質の生産におけるペリプラズム代謝系の優位性を検討する。
③の短寿命物質生産については，現在，細胞質側に触媒部位を持つコハク酸脱水素酵素（SDH）の局在変化を検討している。一方，天然酵素の局在部位がペリプラズム空間（グラム陽性菌の場合は細胞質膜の外側）であるSDHが知られており，これらを酢酸菌で発現させることを検討する。SDHも補欠分子族のアセンブリが重要な酵素であり，簡単な取り組みでは済まないことが予想される。以上のように３つの観点からの取り組みをそれぞれ進めることでペリプラズミック代謝工学を発展させる。
また，酵素の局在化変化を検証する実験にも取り組む。古典的な分画実験には，いわゆるマーカー分子が必要となるので，それを準備する。同時に蛍光タンパク質を用いたイメージングにも着手する。ペリプラズム空間で蛍光能を発揮する赤色蛍光タンパク質を酢酸菌で発現させる。
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