| 研究課題/領域番号 |
20H02910
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
宮園 健一 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任准教授 (90554486)
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| 研究分担者 |
栗崎 晃 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (60346616)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | TGF-β / 相互作用 / タンパク質 / X線結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
トランスフォーミンググロースファクターβ（TGF-β）はサイトカインの一種であり、細胞の増殖や分化、細胞死（アポトーシス）、免疫の調節、血管新生、細胞外マトリックス産生等の多様な生命機能を制御することが知られている。そのため、TGF-βシグナル伝達系の機能不全は、がんや線維症といった重篤な疾病につながる。たとえばがんにおいては、がん微小環境で過剰に存在しているTGF-βの刺激によって、がんの悪性化（浸潤や転移）が誘導されることが知られており、がんの治療のためにはTGF-βシグナルの抑制が効果的であるとされている。TGF-βのシグナルは、細胞内では転写因子SMAD2およびSMAD3（SMAD2/3）のリン酸化へと変換され、リン酸化を受けて活性型となったSMAD2/3を中心とする転写因子複合体が、TGF-βシグナル依存的な転写の制御を担っている。本研究では、がん細胞内で形成されるSMAD2/3を中心とした転写因子複合体の解析とその制御を目指した研究を推進している。
これまでの研究で、SMAD2/3を中心とした転写因子複合体構造として、SMAD3-FOXH1複合体、SMAD2-SKI複合体、SMAD2-MAN1複合体、SMAD2-CBP複合体の構造を明らかにしている。本年度は、SMAD2/3を中心とする転写因子複合体の構造解析としてSMAD2/3-SIP1複合体、SMAD2/3-FOXM1複合体、SMAD2/3-SKI複合体、SMAD2/3-SNON複合体の作製および結晶化・構造解析を試みた。SMAD2/3はC末端側に存在するMH2ドメインを利用して多様な転写因子複合体を形成する。SMAD2およびSMAD3のMH2ドメインは、97%と高いアミノ酸配列の同一性を持つが、本年度の研究では、これらの二つのドメインが異なる生物物理学的性質を持つことを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
大腸菌の異種タンパク質発現系を利用し、これまでにSMAD2/3-SKI複合体、SMAD2/3-SNON複合体の形成に成功している。しかしながら、これらの複合体は通常の緩衝液に対する溶解度が極めて低く、結晶化を行うに十分な濃度のタンパク質複合体を得ることがこれまでにできていない。高濃度のアルギニンを緩衝液中に加えることによって、これら複合体の溶解度の向上を図ることはできたが、X線回折実験に利用可能な高品質なタンパク質結晶を作製することはできなかった。SIP1およびFOXM1は、共にSMAD2/3のMH2ドメインに結合することが知られているが、大腸菌の異種タンパク質発現系を利用して調製したタンパク質を用いてSMAD2/3との相互作用を解析したところ、これらのタンパク質はSMAD2/3に対する結合力があまり高くないことが示唆された。そこで、SIP1およびFOXM1に関しては、SMAD2/3との結合に関与すると予想される領域のペプチドを購入し、別途調製したSMASD2/3との共結晶化を試みた。SMAD2とSIP1ペプチドの共結晶化において、X線回折実験に利用可能な結晶が得られたため、Photon FactoryにてX線回折実験を行ったところ、2.5Å程度の分解能のX線回折データを取得することができた。しかしながら構造解析の結果、SMAD2に対するSIP1の結合は確認できなかった。
SMAD2とSMAD3のMH2ドメインは、他タンパク質との分子間相互作用に利用されるドメインで、非常に高いアミノ酸配列の同一性を持つ。しかしながら、熱安定性解析や、他タンパク質との相互作用解析の結果、SMAD2とSMAD3のMH2ドメインは異なる生物物理学的特性があることが明らかになり、その特性は、わずか数残基の置換によって制御されていることを明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度の研究では、引き続きがんの発生や悪性化に関与する転写因子複合体の構造学的な解析を進める。具体的には、これまでにまだ複合体構造の得られていないSMAD2/3-SKI複合体、SMAD2/3-SNON複合体、SMAD2/3-SIP1複合体、SMAD2/3-FOXM1複合体の大量調製、結晶化及びX線結晶構造解析研究を進めていく。各タンパク質は大腸菌の異種タンパク質発現系を利用して調製する他、短いペプチド断片に関しては化学的に合成して利用する。プルダウンアッセイや等温滴定カロリメトリー、表面プラズモン共鳴等の測定技術を利用し、各タンパク質分子間相互作用を定量的に解析しつつ、安定な複合体が得られる条件の探索を行う。SMAD2/3-SKI複合体やSMAD2/3-SNON複合体に代表される溶解度の低い複合体に関しては、非界面活性剤型スルホベタイン（NDSB）の添加を試みるなど、結晶化に利用可能な安定な複合体が得られる緩衝液条件の探索を行い、安定な複合体が得られ次第結晶化及びX線結晶構造解析実験を進める。SMAD2及びSMAD3のMH2ドメインの性状の差異に関しては、細胞生物学的な解析を開始し、これまでに得られた生物物理学的なデータと統合し論文として発表する予定である。
これまでの研究で、SMAD2/3依存的な転写の活性化に関与するCBPのペプチド断片を利用することによって、TGF-β依存的な転写の活性化を抑制できることが示されている。SMAD2-CBP複合体の構造情報と計算科学の手法を活用することによって設計した、CBP変異体断片は、野生型と比較し50倍程度強くSMAD2/3に結合することが示されており、本年度はこのCBP断片を利用したTGF-βシグナルの制御に関して解析を行う計画である。
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