| 研究課題/領域番号 |
20H02910
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| 研究機関 | 株式会社ファスマック |
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研究代表者 |
宮園 健一 株式会社ファスマック, バイオ研究支援事業部, 研究員(移行) (90554486)
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| 研究分担者 |
栗崎 晃 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (60346616)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | TGF-β / タンパク質分子間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
サイトカインの一種であるトランスフォーミンググロースファクターβ（TGF-β）は、細胞の増殖、分化、細胞死（アポトーシス）、免疫調節、血管新生、細胞外マトリックス産生、老化等の多様な生命機能を制御する。TGF-βシグナル伝達系の機能不全はこれらの生命機能の制御に異常をきたすため、重篤な疾病の原因となることが多い。TGF-βシグナル伝達系の機能不全によって引き起こされる代表的な疾病として、「がん」があげられる。TGF-βは細胞増殖抑制能を有するため、TGF-βシグナルの機能不全によって細胞の異常な増殖、つまりがん化が起こる一方、がん微小環境で過剰生産されるTGF-βシグナルは、がんの悪性化（浸潤や転移）を誘導することが知られている。そのためTGF-βシグナルを人為的に制御する技術は、がんの克服に向けて非常に重要視されている。
これまでに、TGF-βシグナルの刺激に応じて形成される多様な転写因子複合体に着目し、そのタンパク質分子間相互作用形成阻害を通じたTGF-βシグナルの精密な制御を目指した研究を行った。転写因子複合体の形成阻害分子を設計するため、これまでに、SMAD3-FOXH1（転写因子）複合体、SMAD2-SKI（転写抑制因子）複合体、SMAD2-MAN1（シグナル終結因子）複合体、SMAD2-CBP（転写活性化因子）複合体の構造を明らにしており、構造に基づいて設計したCBP改変ペプチドは、TGF-βシグナルの抑制が可能であることを示している。本年度は、タンパク質分子間相互作用の阻害を通じたTGF-βシグナルの活性化を目指し、SMAD2-TMEPAI複合体構造およびSMAD2-Mixer複合体構造に基づいたTGF-βシグナル活性化ペプチドの設計及び機能評価を行い良好な結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
TMEPIやMixerは、SMAD2/3のMH2ドメインに結合し、その機能を調節するSMAD2/3補因子である。これらの補因子は、リン酸化（活性化）されたSMAD2/3の脱リン酸化を引き起こすSMAD2/3補因子MAN1と競合してSMAD2/3に結合する。そこで本年度は、X線結晶構造解析の結果明らかにしたSMAD2-TMEPAI複合体構造、SMAD2-Mixer複合体構造を元に、MAN1と競合しSMAD2/3の脱リン酸化を阻害するペプチドの設計を行った。相互作用解析に利用するSMAD2/3のMH2ドメイン、及びTMEPAI、Mixerは大腸菌の異種タンパク質発現系を利用して大量調製を行った。長さの異なるコンストラクトを多数作製し、等温滴定カロリメトリーによってそれらのSMAD2/3に対する結合力を評価することによって、SMAD2/3との相互作用に必要十分な領域を同定した。次に、複合体構造情報をつかい、in silico解析によって、SMAD2/3との結合力が増強する変異の候補を得た。得られた変異候補を実際に導入し、その効果を等温滴定カロリメトリーによって評価したところ、一部の変異体で良好な結果を得ることに成功した。
SMAD2とSMAD3のMH2ドメインは、他のタンパク質との分子間相互作用に利用されるドメインで、非常に高いアミノ酸配列の同一性を持つ。これまでの研究で、SMAD2及びSMAD3のMH2ドメインに生物物理学的特性の違いがあることを示したが、その特性の違いは細胞内でも発揮されている可能性があることが示された。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究で、TGF-βシグナル伝達系における転写活性化因子CBPの構造を活用することによって、TGF-βシグナルを抑制できるペプチドの設計ができている。そこで本年度の研究では、CBP改変ペプチドとは逆の作用、すなわち、TGF-βシグナルの活性化を誘導可能なペプチドの設計・開発を行う。これまでに、SMAD2/3の脱リン酸化を促進するMAN1と競合してSMAD2/3の脱リン酸化を阻害するTMEPAI・Mixer改変ペプチドの設計・開発を進めており、2023年度の研究では、そのさらなる最適化を進める。具体的には、X線結晶構造解析により決定したSMAD2-TMEPAI複合体構造、SMAD2-Mixer複合体構造を活用し、SMAD2/3に対して強固に結合するペプチド配列を設計し、その機能評価を行う。相互作用解析実験に用いる各タンパク質は、大腸菌の異種タンパク質発現系を利用して大量調製を行い、等温滴定カロリメトリー等の手法で、SMAD2/3-阻害ペプチドの間の結合力を評価する。良好なTMEPAI改変体が得られた場合、細胞内で過剰発現させ、SMAD2/3-MAN1複合体の形成阻害を通じたTGF-βシグナルの活性化が起こるか否かを、レポーターアッセイ系やリアルタイムPCR・ウェスタンブロット等で評価する。また、改変体によるSMAD2/3認識機構を解明するため、SMAD2/3-改変体ペプチド複合体のX線結晶構造解析を行う。
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