| 研究実績の概要 |
CRISPR-Cas系は原核生物がもつ獲得免疫系であり、ウイルスやプラスミドなど可動遺伝因子を分解してそれらによる攻撃から自己を守るという重要な役割を果たしている。CRISPR-Cas系の役割としては、外来侵入核酸から自己を守る生体防御としての側面が主であるが、それ以外にも多様な機能が報告されている。一部の細菌では、トランスポゾン内にCas遺伝子とCRISPRアレイがコードされており、トランスポゼースと協同してDNAの転移に関与する。前年度までに、Cas6, Cas7, Cas8, TniQおよびcrRNAから成る複合体（TniQ-Cascade）を調製し、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析によって分解能3.6Åの三次元マップが得られた。しかし、Cas8, Cas6, TniQのマップを確認することができず、完全な複合体構造の決定には至っていなかった。今年度は、完全な複合体構造の決定を目指して実験を行った。Cas8, Cas6, TniQのマップを確認することができなかった理由として、（１）グリッドを作製する際にこれらサブユニットが複合体から解離してしまった可能性、（２）グリッド作製後もこれらサブユニットは複合体に含まれているが、構造が揺らいでおり明瞭な三次元マップが得られなかった可能性、（３）サンプルのヘテロジェニティーにより、これらサブユニットの占有率が100%でなかった可能性などが推定された。そこで、サンプル調製およびグリッド作製を最適化し、Cas8, Cas6, TniQの三次元マップの取得を試みた。その結果、Cas8に相当する三次元マップを得ることに成功した。一方、Cas6とTniQに関しては、明瞭な三次元マップを得ることはできなかったが、おぼろげなマップを確認することができ、複合体中に全てのサブユニットが含まれていることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Cas6, Cas7, Cas8, TniQおよびcrRNAから成る複合体（TniQ-Cascade）を大腸菌内において産生した。大腸菌の破砕液から各種クロマトグラフィーを利用してTniQ-Cascadeを精製した。最終的には、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて単一の複合体を調製した。サンプルを調製する際、塩濃度、添加剤、緩衝液の種類とpHなども適宜変更し、TniQ-Cascadeの精製条件を最適化した。得られたサンプルについて、Vitrobotを利用してグリッドを作製した。この際に、凍結条件やグリッドの種類を検討した。次に、クライオ電子顕微鏡を利用してデータを収集し、単粒子解析によってTniQ-Cascadeの三次元マップを再構成した。その結果、Cas7に加えてCas8に相当する三次元マップを得ることに成功した。一方、Cas6とTniQに関しては、明瞭な三次元マップを得ることができなかった。しかしながら、Cas6およびTniQと考えられるマップを確認することができ、複合体中に全てのタンパク質サブユニットが含まれていることが明らかとなった。次に、Cas6およびTniQと推定される領域をマスクして再解析した結果、これら2つのサブユニットの三次元マップを低分解能ではあるが得ることができた。
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