| 研究実績の概要 |
CRISPR-associated transposon (CAST) はビブリオ属細菌でよく保存されたトランスポゾンである。CASTは原核生物の獲得免疫として知られるCRISPR-Cas系の機能を利用して配列特異的にDNA間を移動する。CASTによるDNA転移には、CASTには、トランスポジションタンパク質 (TnsA, TnsB, TnsC, TniQ) やCRISPR-Casエフェクターを構成する因子 (Cas6, Cas7, Cas8, crRNA)が関与する。これまでに、Cas6, Cas7, Cas8, TniQおよびcrRNAから成る複合体（TniQ-Cascade）を調製していた。さらに、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析によって、標的2本鎖DNAと結合したTniQ-Cascadeの2.7Å分解能の三次元マップが得られていた。しかし、Cas6とTniQのマップを確認することができず、完全な複合体構造の決定には至っていなかった。今年度は、完全な複合体構造の決定を目指して実験を行った。その結果、分解能は低いもののCas6とTniQの三次元マップも確認でき、ほぼ完全な複合体の構造を決定することに成功した。さらに、大腸菌内においてDNA転移活性を評価する系を確立するとともに、定量PCRによりDNA転移効率を定量的に測定する実験系を構築した。クライオ電子顕微鏡単粒子解析から、標的DNAの選択に重要なPAM配列を特定した。PAM配列に変異を導入した標的DNAプラスミドを作製して、定量PCRによりDNA転移効率を測定した。その結果、TniQ-CascadeによるPAM配列の特異性の一端を明らかにした。また、PAM配列の認識に関与するアミノ酸残基を特定して、変異型TniQ-Cascadeを調製しDNA転移効率を定量PCRにより解析した。
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