| 研究課題/領域番号 |
20H02937
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
山地 亮一 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (00244666)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | メトキシフラボン / GPR97 / 骨格筋 / 筋肥大 |
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| 研究実績の概要 |
筋肥大効果を持つ5-hydroxy-7-methoxyflavone（HMF）がGPR97を介してSRF-REの転写活性を上昇させる分子機構を評価した。GPR97は細胞内で全長をコードする野生型以外に、N末端の細胞外領域を欠失したΔNTF型としても発現する。ΔNTF型は野生型に比べてリガンド非依存的に活性を有しており、既知のGPR97リガンドであるBDPはΔNTF型のSRF-RE転写活性に影響を与えなかったが、HMFはΔNTF型のSRF-RE転写活性を上昇させた。一方、マウス骨格筋におけるGPR97の機能を評価するために、AAV法を利用してコントロールタンパク質であるGFPをマウスの骨格筋で発現させるシステムは構築できた。GPR97を高発現またはノックダウンさせるAAV発現ベクターは作製済みであり、現在骨格筋での発現を確認中である。運動とGPR97の発現の関係を評価するため、単発の強制走行運動（１時間のトレッドミル走行を１回）と自発運動（７日間）でのGPR97とGPR56（コントロールとしての運動遺伝子）の発現を測定した。単発の強制走行運動でGPR97とGPR56の発現が増加し、自発運動ではGPR97の発現が増加した。昨年度に実施した1ヶ月間の強制走行運動でGPR97とGPR56の発現が増加する結果と合わせると、GPR97も運動遺伝子であるが、GPR56とは異なる機構で増加していることが示唆された。さらにin vitroでの運動模倣モデルを構築するために、電気刺激によって筋管細胞を収縮させ、電気刺激によってGPR97とGPR56の発現が増加し、筋肥大が誘発される実験条件を構築した。現在HMFと電気刺激の併用効果による筋肥大について評価している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
GPR97のノックダウンベクターの骨格筋での発現は確認済みであるが、P1A実験室での動物飼育スペースに余裕がなかったため、GPR97の高発現ベクター（構築済み）はまだ発現を確認できていない。現在GPR97の発現を確認中であり、発現が確認できたらHMFの効果を評価する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
筋芽細胞において5-hydroxy-7-methoxyflavone（HMF）がGPR97を介してSRF-REの転写活性を促進したので、筋管細胞において評価する。具体的にはエレクトロポーレーションによりGPR97を高発現させた筋管細胞でHMFによるSRF-REの転写活性を測定する。またHMFがGPR97を介してSRF-RE活性を上昇させる分子機構に関する情報を得るため、SRF自身の活性化あるいはSRFを活性化する因子（例えばMRTF-A）の寄与を評価する。さらにAAV法を利用して下肢の骨格筋でGPR97を高発現させたマウスとノックダウンさせたマウスを作製し、動物レベルでGPR97の骨格筋における役割を評価する。作製後は、筋線維のサイズおよび特徴をそれぞれ組織学的および生化学的に解析する。さらにGPR97をノックダウンさせた下肢の骨格筋またはGPR97を高発現させた骨格筋においてHMFがタンパク質合成を促進するのかをSUnSET法により評価する。さらにin vitroでの運動模倣モデルにおいて電気刺激によってGPR97の発現が上昇し、筋肥大が誘発される結果を得たので、電気刺激による筋肥大効果に及ぼすGPR97のノックダウンの影響を評価する。またHMFによる単独刺激時とHMFと電気刺激による共刺激時での筋管細胞の肥大に及ぼす効果を評価する。運動によるGPR97の発現調節機構に関する情報を得るために、GPR97のプロモーター活性測定系を構築し、in vitroでの運動模倣モデルで評価する。
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