| 研究課題/領域番号 |
20H02945
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| 研究機関 | 岩手大学 |
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研究代表者 |
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| 研究分担者 |
宮崎 雅雄 岩手大学, 農学部, 教授 (20392144)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 低温ストレス / GNOM / 植物 / タンパク質輸送 / ホルモン |
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| 研究実績の概要 |
この研究の目的は、GNOMを中心に低温ストレス反応を調節する分子成分を特定することである。このために、私たちはGNOMの過剰発現と機能ラインを使って間の比較プロテオーム分析を使用さた。プロテオーム解析から、寒冷ストレス反応のいくつかの潜在的な調節タンパク質を特定しました。 寒冷ストレスを調節する重要なタンパク質の1つはアクチンアイソバリアントに関連している。現在、我々は低温ストレス反応の標的タンパク質を機能的に特徴づけている。
トマトの低温ストレス応答におけるGNOM機能を理解するために、トマトのGNOMの特性を調べた。2020年に、トマトのGNOMの2つのアイソバリアントを特徴づけた。 それらは互いに90％の相同性を示し、すべての器官で同様のレベルで発現した。 特定のgRNAプライマーを使用して、SEC7ドメインの3つの場所に変異を導入し植物は組織培養を使用して形質転換され、成長した。また、サンガーシーケンシングにより、植物の変異を確認した。 第一世代の植物の表現型分析を行ったところ、GNOMが植物の発育、追跡、結実に重要な役割を果たしていることが確認された。 3種類のCRISPR変異体はすべて、草丈、葉の発達、果実の形など、さまざまな成長欠陥を示した。
また、国際ジャーナルに3つの論文を掲載された。 さらに、2021年2月8日～11日にかけてオンライン開催された「アメリカ科学振興協会学術集会2021で 本研究室の学生がポスター発表を行い、 細胞生物学部門にてThird Place Winner(3位)に選出された。本研究は、植物の低温ストレス応答における細胞骨格アクチンの働きについて新たな知見を示したもので、概要は世界的に権威のあるサイエンス誌の4月号に掲載された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究の進捗は予想通りでした。比較プロテオミクス分析を実行し、寒冷ストレス反応のいくつかの新しい調節因子を特定した。また、低温ストレスにおける同定されたタンパク質の1つの機能的役割を評価するための予備実験を行った。
CRISPR-Cas9技術を使用して、トマトのGNOM遺伝子にも変異を導入した。 第一世代の植物の表現型分析を行ったところ、GNOMが植物の発育、追跡、結実に重要な役割を果たしていることが確認された。 3種類のCRISPR変異体はすべて、草丈、葉の発達、果実の形など、さまざまな成長欠陥を示した。
シロイヌナズナとトマトの両方のホルモン分析のためにLC-MS / MSの方法を最適化された。 ホルモン分析法セットアップ中に、アスコルビン酸を添加するとホルモンの回収率が高くなることが見つかった。 これは新しい発見であり、メソッドペーパーをまもなく公開する予定である。 また、国際ジャーナルに3つの論文を掲載された。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.GNOMの過剰発現と機能ラインの喪失における比較プロテオミクス分析の確認: 2020年度には、低温ストレス下でのGNOM過剰発現とGNOM機能低下を用いた比較ショットガンプロテオミクス解析を実行された。 結果を確認するために、今年度はco-IPベースの比較プロテオーム解析を使用する。 これらの2つのアプローチは、GNOMによって特異的に輸送されるタンパク質特定し、低温ストレス反応を調節するタンパク質を識別することができる。これらのタンパク質は、低温ストレス反応をどのように調節するかを理解するために、さらに機能的に特徴付けられる。
2.低温ストレスにおけるアクチニソバリアントの機能的役割の理解:比較プロテオミクス分析から、低温ストレス下で特異的に応答する1つのアクチンアイソバリアントを特定された。このアイソバリアントが低温ストレス応答をどのように調節するかを理解するために、変異体と過剰発現ラインを使用する。 さらに、植物ホルモンオーキシン輸送タンパク質の細胞内輸送はアクチンに依存しているため、どのオーキシン関連タンパク質が低温ストレス経路を調節しているかを調べる。
3.トマトでCRISPR誘発GNOM変異体の開発：2021年度には、GNOM-CRISPR変異体のT2世代の低温ストレス応答をスクリーニングする。さらにHomology Directed Repair （HDR）技術を用いて、GNOMのSEC7ドメインの696の位置でのメチオニンからロイシンへの変異を誘導する実験を実行する。この実験は、GNOMがシロイヌナズナとトマトで同様に機能するかどうかを確認できる。
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