| 研究課題/領域番号 |
20H02947
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
大徳 浩照 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 講師 (30361314)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ヒスチジンメチル化 / タンパク質メチル化 / METTL9 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者は、独自のメチル化修飾検出法として、対象とするタンパク質を酸加水分解してメチルアミノ酸をLC-MS/MS分析する方法を確立し、これにRNAiスクリーニングを組み合わせることで、ヒスチジン残基のπメチル化を触媒する酵素METTL9を世界で初めて同定した。本研究計画では、METTL9について3つの角度から解析を行っている。① METTL9の酵素活性を制御する分子メカニズムの解明：解析の過程でMETTL9自身のヒスチジン残基がメチル化されていることを見出した。この修飾がMETTL9の酵素活性に与える影響を検証するため、メチル化部位をMALDI-TOF/MSで決定し、その部位をフェニルアラニンに置換したHF変異体タンパク質を精製して、基質であるS100A9に対するメチル化活性を評価した。しかし、WTとHF変異体で顕著な差は見られなかった。一方、METTL9の新規の翻訳後修飾として糖鎖の可能性を見出してた。
② ヒスチジンメチル化が基質分子の機能に与える影響の解明：METTL9の基質であるS100A9のヒスチジンメチル化部位は、C末端側の亜鉛結合モチーフに存在したため、ヒスチジンメチル化が亜鉛結合活性に与える影響をin vitroで検討した。S100A9の合成ペプチドを用いた亜鉛結合実験の結果、METTL9の標的部位である107番目のヒスチジンメチル化は亜鉛結合を部分的に阻害することが分かった。
③ 線虫を用いたMETTL9の生物学的意義の解明：線虫のmettl9遺伝子のオルソログと考えられるmetl-9の欠失変異体を2系統入手し、表現型の解析を 行っているが、今のところ野生型との差異は見いだせていない。酵素活性については、metl-9欠失変異体の全破砕液を酸加水分解する方法やマウスS100A9に対して、メチル化実験を行っているが、メチル化活性を示す結果は得られていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
METTL9自身のヒスチジン残基がメチル化部位は2カ所存在することをMALDI-TOF/MSで決定したが、その2カ所をフェニルアラニンに置換した2HF変異体タンパク質を精製して、LC-MS/MSによるヒスチジンメチル化レベルの定量を行ったところ、WTと差が認められなかった。この結果はすなわち、他のヒスチジン残基もメチル化されることを示唆しているが、MALDI-TOF/MSの結果とは矛盾する。さらにMETTL9の5カ所全てのヒスチジン残基を変異させても、LC-MS/MSでヒスチジンメチル化レベルが残存したことから、細胞内でMETTL9と結合する新規の基質が分析サンプルに混在している可能性が考えられた。現在、実験系を再考することで、バックグランドの低下を試みつつ、この結合因子の同定も進めている。
一方、基質であるS100A9に対するメチル化活性を評価については、当初の計画を達成した。
なおコロナ禍の影響により、大学院生が実験に充てられる時間が減少したため、当初予定した実験計画を遂行できなかった。これが研究計画が「やや遅れている」原因であり、次年度以降は、実験スケジュールを工夫することで改善したいと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
METTL9自身のメチル化については、いったんMALD-TOF/MSによる部位の同定までにとどめ、今年度発見した新たな翻訳後修飾であるN結合型糖鎖修飾とその機能的意義について解析を進めていく予定である。METTL9は小胞体に局在し、N末端側にシグナルペプチドと予想される配列を有することから、N結合型糖鎖修飾された後に細胞外に分泌される可能性も考えられる。
一方、METTL9の新規結合タンパク質については、引き続き解析を進め、基質の可能性や制御因子の可能性について検証する。従来の免疫沈降法に加え、近位依存性ビオチン標識技術（BioID）も採用することで、より広範な結合因子の探索を行う予定である。
線虫metl-9については、その相同性から哺乳類METTL9のオルソログと考えられるが、これまでに活性が認められていないことから、メチル化酵素以外の機能を有している可能性がある。今後はそれらを考慮した検討を進める。
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