| 研究課題/領域番号 |
20H02949
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| 研究機関 | 福島大学 |
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研究代表者 |
松田 幹 福島大学, 食農学類, 教授 (20144131)
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| 研究分担者 |
宮田 真路 東京農工大学, 農学部, 准教授 (60533792)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 受精 / 精子プロテアーゼ / アクロシン / 卵透明帯 / ZPタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
R3年度も引き続き活性を持つ組換え型のアクロシンとMBP-ZPタンパク質を用いてin vitroでの生化学的研究を実施した。これまでに５種の哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ）の精子プロテアーゼについて前駆体タンパク質の発現と、プロセシングによる成熟型への変換に成功しており、これらの成熟型タンパク質のプロテアーゼ活性の定量的解析を試みた。これまでにSDS-電気泳動およびザイモグラフィーでの活性染色によりプロテアーゼ活性を測定してきたが、生（native）の状態での組換体タンパク質のプロテアーゼ活性を、合成基質を用いて比色定量した。哺乳類のアクロシンの比較対象として鳥類のアクロシンも同様に分泌発現させ活性を測定した。トランスフェクションによりアクロシンを分泌発現させたS2細胞の培養上清を限外ろ過により濃縮し、トリプシン用合成基質BAPAを用いて比色定量した。その結果、５種類の哺乳類アクロシンを発現させたS2細胞培養上清では、いずれもBAPA分解活性が検出され、二種類の動物の活性が顕著に高く検出された。これはザイモグラフィーで測定したゼラチン消化（溶解）活性とは必ずしも一致しておらず、基質に依存して動物種での酵素活性に差異があることが明らかとなった。一方、卵膜ZP糖タンパク質については、これまでにブタの卵膜を構成するZP2, ZP3およびZP4をMBPとの融合タンパク質として分泌発現させることに成功しており、R3年度では、これらのZP糖タンパク質がブタの組換え方アクロシンで切断、分解されるかを調べた。ブタの系で、組換え型プロテアーゼとZP糖タンパク質をSP2細胞で分泌発現させ、限外ろ過で濃縮した後に混合し、酵素反応させた後に電気泳動・免疫ブロット法によりMBP-ZP融合タンパク質の分解の程度を調べたが、これまでのところ、明確な断片化は検出されていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに前駆体タンパク質のレベルで分泌発現させプロセシングによる成熟型への変換にも成功していた５種の哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ）の精子プロテアーゼについて、細胞培養上清を用いて合成基質による高感度活性測定系が確立できたことの意義は大きく、今後、キネティクスなどの酵素科学的解析が期待できる。また、MPB融合タンパク質として分泌発現させたZPタンパク質を用いて、酵素との相互作用について、基質となって分解、断片化されるか否かをSDS-PAGEおよび免疫ブロット法により調べた。まずはMBP-融合ZPタンパク質を発現させた細胞の培養上清にアクロシン発現の細胞培養上清を添加してみたが、明確な断片化は確認できず、今後、もう少し培養上清を濃縮し、酵素、基質の濃度を高めて検討する必要がる。以上のように、当初の計画の一部は達成できなかったが、次年度以降に予定していた計画の一部を達成することができた。このような状況から研究は概ね順調に進捗していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに、５種類の哺乳類アクロシンを発現させたS2細胞培養上清では、いずれもBAPA分解活性が検出され、二種類の動物の活性が顕著に高く検出された。今後は、ペプチド合成基質なども含めて基質濃度に依存した酵素反応速度の定量解析などの酵素科学の動力学解析を進め、動物種間での差異とアミノ酸配列および立体構造の差異との比較解析進める。一方、これまでに、分泌発現させたMBP-融合ZPタンパク質の、同様に発現させたアクロシンによる明確な断片化は確認できていないため、今後は、培養上清を限外ろ過等で濃縮し、酵素、基質の両方の濃度を高めて酵素分解断片化の有無および断片化での切断部位の同定を試みる。さらに免疫沈降法、プルダウン法などを用いて、MBP-融合ZPタンパク質と精子プロテアーゼとの結合能（複合体形成能）を調べ、卵膜ZPタンパク質がアクロソーム結合型プロテアーゼとの結合を介した精子受容体となる可能性について検討を進める。
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