研究課題
植物は病原菌の分子パターンに続いてエフェクターを認識し、二段階の免疫応答を始動する。いずれにおいても、NADPHオキシダーゼによって急激な活性酸素種 (ROS) の生成反応であるROSバーストが誘導される。ROSバーストは第一では弱く、第二ではより激しく起こり、免疫細胞死に重要な役割を果たす。第一と第二では異なる遺伝子や反応が誘導されるが、同じROSに起因する応答であり、その機構は未詳である。ROSはそのセンサータンパク質を酸化することによって構造を変化させ、様々な細胞応答を引き起こすと考えられている。ROSであるH2O2は、そのセンサータンパク質のシステインのチオール基 (-SH) を酸化し (-SOH；スルフェン酸)、分子内または分子間でジスルフィド結合 (-S-S-) を形成する。あるいは、スルフェン酸が還元型グルタチオン (GSH) と反応してグルタチオン化(-S-SG)することによってROSセンサータンパク質の構造を変化させ、様々な細胞応答を引き起こすことが知られている。PTIとETIにおけるROSセンサーを比較することによって、ROSの生産量に依存した防御応答の調節機構を紐解くことができると予想される。しかし、植物免疫応答に関与するROSセンサーについては未開拓であり、ブラックボックスとなっているため、ROSによる免疫誘導の分子機構は未詳である。本研究では、ROSセンサーと結合する酵母のYAP1を用いることによって、ROSセンサータンパク質を精製する系を思考した。本研究では、植物免疫応答の鍵を握るROSセンサータンパク質を網羅的に探索し、機能を明らかにすることでROSによる免疫統御機構を明らかにすることを目的とする。
1: 当初の計画以上に進展している
初年度は、ベンサミアナタバコ (Nicotiana benthamiana) に細菌のべん毛タンパク質に由来するflg22によってPTIを誘導し、さらにジャガイモの抵抗性遺伝子であるRpi-blb2を導入したベンサミアナタバコ葉にETIを誘導し、それぞれで生産されたROSの一つである過酸化水素によってスルフェニル化されるROSセンサータンパク質を精製した。葉から精製した標的タンパク質を Isobaric Tagでそれぞれ標識し、iTRAQ法によってLC-MS/MS解析した。この方法では、２段階目のMS解析で標識したタンパク質の質量に変化をもたらすことができるため、すべてのサンプルを混合して定量的なプロテオーム解析が可能となる。網羅的なプロテオーム解析の結果、タンパク質リン酸化酵素、イオントランポーター、防御関連遺伝子、酸化還元反応などが得られた。本年度においては、これらROSセンサーの候補タンパク質の中で、免疫応答を正に制御するCa2+チャネルであるNbGLR (glutamate receptor-like) をROSセンサー候補として着目した。NbGLRがROSセンサーとしてROSを受容し、その活性が増加すると、Ca2+が細胞内に流入することによって防御応答が亢進されるものと思われる。そこで、まずベンサミアナタバコにおいて本遺伝子をサイレンシングし、灰色かび病菌 (Botrytis cinerea) を接種した結ところ、対照区に比べて病斑が有意に拡大した。この結果は、本候補タンパク質が病害抵抗に関与していることを示している。さらに、ウリ類炭疽病菌 (Colletotrichum orbiculare)を接種した場合においても同様の結果が得られた。
ROSセンサーによるシグナル伝達は、ROS受容システインがスルフェン酸へと酸化されることに起因する。しかし、スルフェン酸は不安定であり、速やかに反応するため生体内での検出が難しい。申請者は、スルフェン酸と特異的に結合する化合物であるジメドンを用いることで、生体内でのROSセンサーの酸化を安定的に検出することができると考えた。ジメドンと結合したシステインは特異的抗体を用いて検出することができる。この方法により、免疫応答を誘導した植物内におけるROSセンサー候補 (NbGLR) の酸化状態を評価する。さらに、NbGLRに含まれるシステイン残基に変異を加え、ジメドンの結合を評価することにより、スルフェニル化の標的となるROS受容システインを決定する。具体的には、NbGLRのリコンビナントタンパク質を大腸菌で作製し、H2O2を反応させることによって、in vitroでのNbGLRをスルフェニル化させる。その後、スルフェニル化したシステインと特異的に結合するdimedoneを反応させ、抗システイン－dimedone抗体を用いてウエスタン解析する。さらに、システインをアラニンに置換したNbGLRのリコンビナントタンパク質と比較することによってスルフェニル化したシステインを同定する。研究材料として用いるベンサミアナタバコは、アグロバクテリウムを介したタンパク質の迅速な一過的発現および遺伝子の発現抑制が容易である。NbGLRを発現抑制した植物に対し、上記の実験により決定された標的システインをセリンに置換した変異タンパク質を発現させ、免疫応答に対する機能的な影響を評価する。これらの方法により、NbGLRのROS受容能とROS受容システインを決定し、免疫応答における機能を明らかにする。
すべて 2021
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Journal of Pest Science
巻: 94 ページ: 505-515
10.1007/s10340-020-01276-w
アグリバイオ
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