| 研究課題/領域番号 |
20H03002
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| 研究機関 | 中部大学 |
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研究代表者 |
大場 裕一 中部大学, 応用生物学部, 教授 (40332704)
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| 研究分担者 |
新美 輝幸 基礎生物学研究所, 進化発生研究部門, 教授 (00293712)
重信 秀治 基礎生物学研究所, 新規モデル生物開発センター, 教授 (30399555)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ヘイケボタル / RNAI / 発光器 |
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| 研究実績の概要 |
ポストホタルゲノムの課題のうち、larval RNAiについてはdoublesex遺伝子のノックダウンによる発光器およびその他ホタルに特徴的な性的二型の進化発生学的メカニズムの解明を目指した研究を行い、幼虫の雌雄判定の方法確立をさらに検討した。終齢幼虫における卵巣の有無を強い光や紫外線を当てたときの蛍光などによって検出する方法を検討した。CRISPRについては、Doublesex遺伝子のトランスクリプトの解析をさらに進めた。ゲノムデータからわかっているdoublesex遺伝子の配列情報をもとに特異的プライマーを作成し、RT-PCRを行ったところ、雌雄ともに複数のバンドが得られたので、そのクローニングを進めている。
黒化個体系統の責任遺伝子特定のために、黒化個体と野生型個体との掛け合わせ実験を開始した。そのために、新たに飼育水槽を複数立ち上げた。また、RAPD-PCRによる性特異的なDNA断片の取得も試みた。性染色体があっても小さいと予想されるためか、何度もトライしたが今のところ良い結果は得られていない。ホタル全ゲノムのHiFi解析を進めているので、そちらから性染色体の情報に辿り着けることを期待してゲノム解析もさらに進めている。
日本各地の個体群についてゲノムリシーケンスを行った。その結果、北海道の個体群において遺伝的多様性が非常に低いことが判明した。ヘイケボタルの南限である長崎の個体の遺伝的多様性は低くはなかった。
知多郡東浦町の個体群については、ビデオ撮影した発光の動画の解析を進めた。飛翔オスの撮影は難しかったが、地上に着地した静止オス、およびほとんど飛翔しないメスの記録を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Larval RNAiの準備としてヘイケボタルの幼虫時における雌雄判別法の探索を続けたが、個体を弱らせることになっても殺さずに判別できた方がよいので、内部形態に着目したが、過去の文献に記述があったような卵巣を確認することができなかった。おそらく過去の文献は卵巣と脂肪球を見間違えていたのだろうと結論し、外部・内部形態に基づく雌雄判定方法の発見を断念することにした。RAPD-PCRでは、性特異的な明確な増幅バンドは今のところ検出されていない。
Doublesex遺伝子のトランスクリプトの解析については、RT-PCRによる網羅的な検出を試みたが、今のところどちらかの性に特異的なエクソンをもつバリアントは得られていない。
ゲノムリシーケンスの結果、北海道の個体群において遺伝的多様性がとりわけ低いという結果が得られた。これは、北海道の集団が個体数ではなく遺伝的に絶滅の危機にあることを示唆するものである。
黒化個体と野生型個体の交配実験をスタートした。両親となった個体は冷凍してこれもリシーケンスする。
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| 今後の研究の推進方策 |
個体を弱らせることになっても判別できる方法の確立を目指し、内部形態や性特異的遺伝子の発見などを試みたが、できなかった。ヘイケボタルにはY染色体が存在するという過去の記録があるので、RAPD-PCRをさらに進める予定である。ただし、Y染色体がかなり小さいと考えられることや、Y染色体が存在しないかもしれないという報告もあるので、成功するかどうかはわからない。そこで、それが失敗した時のためにDoublesexのトランスクリプトの解析を進めているが、今のところ性特異的なエクソンを持つものは見つかっていない。もしそれが見つかれば、そのエクソン部位を使ってRNAiを行えば、原理的にはRNAiの効果が出た個体の性がはっきりする。Doublesexが発現する蛹期と成虫期の両方で解析を行う必要がある。
黒化個体と野生型個体の交配実験をスタートし、ようやくF1の幼虫が育っているところである。両親となった個体は冷凍してこれもリシーケンスする予定。F1の幼虫を絶やさないように飼育を続けなくてはいけない。
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