尿サンプル由来オルガノイドを用いた多角的な研究:イヌ膀胱がん克服にむけて

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20H03145
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 臼井 達哉 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 特任講師 (80727652)
• 研究分担者: 恒富 亮一 山口大学, 医学部附属病院, 講師 (10420514) ; 打出 毅 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (20327456) ; 大松 勉 東京農工大学, 農学部, 准教授 (60455392)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 犬 / 膀胱がん / オルガノイド / 抗がん剤

研究実績の概要

イヌの膀胱がんは、悪性度が非常に高く有効な治療法が存在しないことから、新規治療法の開発が獣医療の現場において喫緊の課題となっている。本研究では、新規膀胱がん幹細胞関連遺伝子の機能を解析し、新規治療薬の開発につなげる。さらに、イヌ膀胱がんオルガノイドを用いた新たな培養細胞の創出および臨床検査システムの開発を行うとともに、膀胱がん罹患犬の尿中細菌叢解析によって、オルガノイドの増殖・生存を制御する細菌種を同定し、新たな治療標的とする。今年度は独自の培養液の組成を探索し、新たな培養方法(2.5D膀胱がんオルガノイド培養法)を開発した。作製した2.5D膀胱がんオルガノイドは、細胞増殖スピードが3D膀胱がんオルガノイドと比較して亢進したが、尿路上皮細胞マーカーの発現や、in vivoでの腫瘍形成能および抗がん剤に対する反応性といった3D膀胱がんオルガノイドの性質は維持されることが示された。また、2.5Dオルガノイドを用いて、3Dオルガノイドや2D細胞株との比較を行うことで膀胱がんの新たな幹細胞マーカーの同定が可能となることを明らかにした(Amira et al., Scientific Reports, 2020)。また28頭の膀胱がん罹患犬の前向き臨床研究を実施し、オルガノイドにおける抗がん剤感受性が治療効果と相関する傾向を明らかにした。さらに、新規分子標的薬であるトラメチニブが犬膀胱がんオルガノイドの増殖能をbasal型からluminal型への形態転換を介して抑制することを明らかにした。In vivoにおいても、トラメチニブの投与はマウスに移植したオルガノイドから発生した腫瘍の成長を阻害することが示された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

各患畜由来の膀胱がんオルガノイドを二次元化する独自の培養液の組成を探索し、新たな培養方法(2.5D膀胱がんオルガノイド培養法)を開発した(特願2020-051580)。作製した2.5D膀胱がんオルガノイドは、細胞増殖スピードが3D膀胱がんオルガノイドと比較して亢進したが、尿路上皮細胞マーカーの発現や、in vivoでの腫瘍形成能および抗がん剤に対する反応性といった3D膀胱がんオルガノイドの性質は維持されることが示された(Amira et al., Scientific Reports, 2020)。
新規分子標的薬であるトラメチニブが犬膀胱がんオルガノイドの増殖能をbasal型からluminal型への形態転換を介して抑制することを明らかにした。In vivoにおいても、トラメチニブの投与はマウスに移植したオルガノイドから発生した腫瘍の成長を阻害することが示された。さらに、トラメチニブを長期投与したマウスの腫瘍から再度オルガノイドを作成して解析したところ、カルボプラチン処置への感受性の上昇が認められ、そのメカニズムとしてMSH2発現の亢進が関与することが示唆された(第143回日本薬理学会関東部会において発表、Elbadawy et al., Cancer Biology & Therapy. In press)。
28頭の膀胱がん罹患犬の前向き臨床研究を実施し、オルガノイドにおける抗がん剤感受性が治療効果と相関する傾向を明らかにした(第17回日本獣医内科学アカデミー学術集会にて発表)。

今後の研究の推進方策

①尿サンプル由来イヌ膀胱がんオルガノイドを用いた臨床検査システムの開発
実験用の正常犬、東京農工大学付属動物病院に来院する良性膀胱疾患および膀胱がん罹患犬の尿サンプルを用いてオルガノイドを作製し、各病態ごとの形成効率や上皮構造、遺伝子発現パターンの違いをそれぞれ検討する。顕著なオルガノイド形成能および悪性度の高い上皮構造が認められた患畜においては抗がん剤感受性検査を行い、検査結果を担当獣医師に伝えた後に治療方針を決定し、治療開始後3, 6, 12か月における患畜の状態や治療効果の情報を収集し、解析を行う。これらの前向き臨床研究を長期的に行い各患畜の予後に関するデータを収集することで、尿サンプル由来オルガノイドを用いた新たな健康診断および治療選択システムを確立し、イヌ膀胱がんの予防や早期発見、治療の最適化を目指す。

②尿中細菌叢による膀胱がん幹細胞制御機構の解明
正常犬、膀胱炎や過形成などの良性膀胱疾患犬、膀胱がん罹患犬の尿を用いてDNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いて細菌遺伝子である16S rRNAの解析を行う。具体的には、健常犬や良性膀胱疾患犬に比べて膀胱がん罹患犬の尿中で割合が増加あるいは減少する細菌種を同定する。膀胱がん罹患犬においては、尿サンプル由来オルガノイドの増殖能、抗がん剤感受性、年齢、犬種、性別など様々なファクターと尿中の細菌叢の構成の相関をクラスター解析によって検討する。オルガノイド形成能が高い膀胱がん罹患犬の尿中で特異的に増加している細菌種については、菌の分離・培養を行い、オルガノイドの増殖や生存率、抗がん剤感受性に及ぼす各細菌の影響を検討することで、膀胱がん幹細胞を制御する尿中細菌種の役割を明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] Establishment of 2.5D organoid culture model using 3D bladder cancer organoid culture (2020)
  • 著者名/発表者名: Amira Abugomaa , Mohamed Elbadawy, Megumi Yamanaka, Yuta Goto, Kimika Hayashi, Takashi Mori , Tsuyoshi Uchide, Daigo Azakami, Ryuji Fukushima, Toshinori Yoshida, Makoto Shibutani, Risako Yamashita, Mio Kobayashi, Hideyuki Yamawaki, Yuta Shinohara, Masahiro Kaneda, Tatsuya Usui, Kazuaki Sasaki
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 9393
  • DOI: 10.1038/s41598-020-66229-w
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 尿サンプル由来イヌ移行上皮癌オルガノイド培養法を用いた 抗がん剤感受性検査の開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 佐藤よもぎ, モハメドエルバダウィー、山本晴、森正弘、森崇、中川貴之、前田真吾、野口俊助、岩井聡美、呰上大吾、打出毅、福島隆治、臼井達哉、佐々木一昭
  • 学会等名: 第17回日本獣医内科学アカデミー学術集会
• [学会発表] 犬膀胱がん2.5Dオルガノイド培養法の確立 (2020)
  • 著者名/発表者名: アミラ アブゴマー、臼井 達哉、佐々木 一昭
  • 学会等名: 第163回日本獣医学会学術集会
• [学会発表] オルガノイド培養法を用いた犬膀胱がんに対するTrametinibの薬効薬理評価 (2020)
  • 著者名/発表者名: ○後藤 悠太，臼井 達哉，エルバダヴィー モハメド ，林 希佳，山中 恵
  • 学会等名: 第143回日本薬理学会関東部会
• [産業財産権] 特許権 (2020)
  • 発明者名: 臼井達哉 佐々木一昭 他
  • 権利者名: 臼井達哉 佐々木一昭 他
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2020-051580