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2021 年度 実績報告書

臨床グレードの犬のiPS細胞を用いた運動器再生医療の確立

研究課題

研究課題/領域番号 20H03156
研究機関日本大学

研究代表者

枝村 一弥  日本大学, 生物資源科学部, 教授 (80366624)

研究分担者 村田 大紀  佐賀大学, 医学部, 助教 (00772683)
塩澤 誠司  久留米大学, 医学部, 准教授 (10447039)
鳩谷 晋吾  大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (40453138)
研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード再生医療 / 運動器疾患 / iPS細胞 / 間葉系幹細胞 / 犬 / 獣医
研究実績の概要

臨床グレードの犬のiPS細胞の運動器再生医療を確立するために以下の検討を行った。
1) 犬のiPS細胞の樹立効率の向上(枝村、塩澤):従来まで、ウイルスベクターを用いずにElectroporation法にて犬のiPS細胞の作製を行ってきたが、多くの株を得るためには改善が必要であった。そこで、新たにRNA transfection法を用いて、成犬の皮膚線維芽細胞からiPS細胞の樹立を試みた。その結果、RNA transfection法単独では、犬のiPS細胞は樹立できなかったが、両者を組み合わせることで樹立効率が大幅に向上した。
2) 犬のiPS細胞から間葉系幹細胞への分化誘導法の確立(枝村、鳩谷):犬のiPS細胞から神経堤細胞を経由する手法を用い、間葉系幹細胞への分化誘導を試みた。その結果、プラスチック培養器に接着する線維芽細胞様細胞が得られた。これらの細胞は、CD29、CD44、CD90が陽性、CD34とCD45が陰性であることが明らかになり、骨、軟骨、脂肪への三分化能も有していた。また、間葉系幹細胞への分化能の高いiPS細胞株の特定にも成功した。
3) 犬のiPS細胞由来間葉系幹細胞の軟骨分化誘導能の検証(枝村): 前検討で得られた犬iPS細胞由来間葉系幹細胞を、軟骨分化誘導培地を用いてペレット培養法にて3週間培養した。その結果、白い軟骨様細胞塊が得られ、アルシアンブルー染色で青染した。これらの所見から、犬iPS細胞由来間葉系幹細胞は軟骨細胞への分化能を有していることが示された。
4) iPS細胞から靱帯様組織体を作製するための手法の確立(村田):前年度に続き、ヒトiPS細胞由来間葉系幹細胞およびウサギ脂肪由来幹細胞から靱帯様組織体を作製し、それらの方法の改良を行った。それにより、犬iPS細胞由来間葉系幹細胞を用いた靱帯様組織体を作製するための手法を見出すことができた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

従来から用いてきた成犬の皮膚から樹立したiPS細胞は、間葉系幹細胞への分化能が低いことが判明し、研究を律速させるためには、新たなiPS細胞株を樹立する必要があった。そのため、研究の進捗が少し遅れたが、分化能のより高い犬のiPS細胞の樹立に成功したため、次年度の研究は問題なく遂行でき、遅れは取り戻せるものと考えている。

今後の研究の推進方策

臨床グレードの犬のiPS細胞を用いた運動器再生医療を確立する目的で、今後は以下の項目の検討を継続的に行う。
1) 犬のiPS細胞由来間葉系幹細胞の安全性評価(枝村、鳩谷、塩澤):犬iPS細胞由来間葉系幹細胞を、SCIDマウスの精巣内および静脈内に投与して造腫瘍試験を行う。さらに、犬の関節内に投与した際の安全性を確認する目的で、正常犬の膝関節内にiPS細胞由来間葉系幹細胞を投与し、経時的に血液検査、X線検査、超音波検査、関節鏡検査、CT検査を行って有害事象の有無を確認する。
2) 犬の iPS細胞由来軟骨組織の硬度および特性解析(枝村):前年度までに確立した手法を用いて、犬の iPS細胞由来間葉系幹細胞から軟骨組織を作製する。得られた軟骨組織の硬度をプロービングセンサーにて計測し、正常な犬の軟骨の硬度と比較する。また、得られた組織の特性を解析する目的で、遺伝子発現、表面マーカー、基質産生能の評価を行う。さらに、病理組織学的検査を行って、正常な犬の軟骨組織と比較する。
3) 三次元細胞積層技術を用いた靱帯様組織体の創生と靱帯設置位置の検討(枝村、村田):まずは、犬のiPS細胞由来間葉系幹細胞からなる細胞凝集体を作製する。次いで、剣山のような極細ニードルを有する3Dバイオプリンターを用いた三次元細胞積層技術により、靱帯様組織体の作製を行う。次いで、得られた靱帯様組織体の引っ張り強度を測定して、正常な犬の前十字靱帯との強度を比較する。さらに、病理組織学的検査を行って、正常な犬の前十字靱帯の構造と比較する。最後に、死体犬の膝関節において、前十字靱帯の前内側帯および後外側帯の付着部と同じ位置に作製した靱帯様組織体を設置して、引っ張り強度と膝関節の安定性を評価する。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2022 2021

すべて 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 2件、 招待講演 2件)

  • [雑誌論文] Non-viral derivation of a transgene-free induced pluripotent stem cell line from a male beagle dog2021

    • 著者名/発表者名
      Yoshimatsu Sho、Edamura Kazuya、Yoshii Yumi、Iguchi Aozora、Kondo Hirotaka、Shibuya Hisashi、Sato Tsukika、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
    • 雑誌名

      Stem Cell Research

      巻: 53 ページ: 102375~102375

    • DOI

      10.1016/j.scr.2021.102375

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Non-viral Induction of Transgene-free iPSCs from Somatic Fibroblasts of Multiple Mammalian Species2021

    • 著者名/発表者名
      Yoshimatsu Sho、Nakajima Mayutaka、Iguchi Aozora、Sanosaka Tsukasa、Sato Tsukika、Nakamura Mari、Nakajima Ryusuke、Arai Eri、Ishikawa Mitsuru、Imaizumi Kent、Watanabe Hirotaka、Okahara Junko、Noce Toshiaki、Takeda Yuta、Sasaki Erika、Behr Rudiger、Edamura Kazuya、Shiozawa Seiji、Okano Hideyuki
    • 雑誌名

      Stem Cell Reports

      巻: 16 ページ: 754~770

    • DOI

      10.1016/j.stemcr.2021.03.002

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] 犬の臍帯由来人工多能性幹細胞の樹立2022

    • 著者名/発表者名
      山﨑敦史,立花聖果,枝村一弥
    • 学会等名
      第21回日本再生医療学会総会
  • [学会発表] 獣医再生医療がヒトの再生医療に貢献できること -One HealthとTranslational medicine-2022

    • 著者名/発表者名
      枝村一弥
    • 学会等名
      第21回日本再生医療学会総会
    • 招待講演
  • [学会発表] ウサギ脂肪由来幹細胞からなるscaffold-free 3次元構造体による膝蓋腱再生2022

    • 著者名/発表者名
      宗像季生子, 村田大紀, 藤本亮太, 高尾省子, 三宅美保, 野中俊宏, 永石友公子, 中村アンナ, 中山 功一
    • 学会等名
      第21回日本再生医療学会総会
  • [学会発表] 獣医学領域における再生医療の現状 何ができるのか? 何が真実か2021

    • 著者名/発表者名
      枝村一弥
    • 学会等名
      湘南臨床研究会
    • 招待講演
  • [学会発表] Developing a 3D hiPSC-derived culture model system for inducing endogenous tau aggregation2021

    • 著者名/発表者名
      Sumihiro Maeda, Hayato Hiramine , Mitsuru Ishikawa, Ikuko Koya, Ryosuke Nagashima, Seiji Shiozawa, Mari Nakamura, Manabu Itoh, Hideyuki Okano
    • 学会等名
      International Society for Stem Cell Research 19th annual meeting
    • 国際学会
  • [学会発表] hiPSC3D培養モデルを用いた内在性タウタンパク質凝集誘導系の開発2021

    • 著者名/発表者名
      平峯勇人, 前田純宏, 石川充, 古家育子, 永島崚甫, 塩澤誠司, 中村真理, 伊藤学, 岡野栄之
    • 学会等名
      第40回日本認知症学会学術集会
  • [学会発表] イヌiPS細胞から間葉系幹細胞の誘導の試み2021

    • 著者名/発表者名
      塚本雅也, 川端千晶, 木村和人, 杉浦喜久弥, 鳩谷晋吾
    • 学会等名
      第164回日本獣医学会学術集会
  • [学会発表] Tendon/ligament regeneration using a scaffold-free biofabricated 3D construct of autologous adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in rabbits2021

    • 著者名/発表者名
      Daiki Murata, Ryota Fujimoto, Shoko Takao, Miho Miyake, Anna Maria Nakamura, Koichi Nakayama
    • 学会等名
      The 6th Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society World Congress
    • 国際学会

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公開日: 2022-12-28  

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