新規プロテオーム解析を駆使した転写終結・ポリA付加部位選択機構の解明

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20H03182
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 山口 雄輝 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (50345360)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: RNAポリメラーゼII / 選択的RNAプロセシング / 核内構造

研究実績の概要

本研究の目的は転写終結・3’プロセシング部位の選択機構について「反応場(構造)」と「機能」の両面から明らかにすることである。それぞれ以下で詳述する独自の実験系を用いて課題に取り組んでゆく。
構造面からのアプローチ：申請者らは液液相分離によって形成される細胞内ドメインの構成成分を解析する新規プロテオーム解析法を開発した。本研究ではPBAP法を用いてNELF bodiesの構成成分を網羅的に同定する。今年度は研究計画に従って、抗NELF抗体を用いたPBAP解析の条件検討を行った。条件の確立後、1,6-ヘキサンジオール-/+でNELF周辺因子のビオチン化反応を行い、SILAC法により比較定量プロテオーム解析を行った。さらに、PBAP法の特徴を活かしてNELF以外の核内構造体についても解析を行うべく、予備実験を進めた。
機能面からのアプローチ：申請者らは転写終結・3’プロセシング部位の変化を検出できるRFP/GFPデュアルレポーターアッセイ系を確立した。本研究ではこの系を用いて機能的スクリーニングを行い、選択的PASやcryptic PASの制御に関わる因子群を網羅的に同定する予定だった。しかし今年度、研究計画に従ってpooled sgRNAライブラリースクリーニングの予備検討を行ったところ、RFP/GFPの蛍光量比が個々の細胞間でかなりバラつき、集団としての解析はできてもシングルセルレべルでは難しいことが判明した。そこで方針を切り替え、選択的ポリ(A)付加により異なるアイソフォームを発現する内在遺伝子に注目し、2つのアイソフォームを二重免疫染色することによりシングルセルレベルで選択的PASを可視化する系を構築した。概念実証がほぼ得られたので、今後はこの系を用いて遺伝学的スクリーニングを進めていく。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

構造面からのアプローチについては、当初計画にあったRNAポリメラーゼIIやNELF以外の核内構造にも展開しており、当初の計画以上に進んでいる。一方、機能面からのアプローチについては、当初計画したRFP/GFPデュアルレポーターアッセイ系ではライブラリースクリーニングを進めるのが難しいと判断し、方向転換を余儀なくされた。しかし選択的ポリ(A)付加により異なるアイソフォームを発現する内在遺伝子に注目し、2つのアイソフォームを二重免疫染色することによりシングルセルレベルで選択的PASを可視化する系を新たに構築することができた。この系でライブラリースクリーニングを行う概念実証がほぼ得られたので、大きな遅れなく進められていると自己評価している。

今後の研究の推進方策

構造面からのアプローチ：今後はSILAC法により得られたプロテオームデータの解析、バリデーションを進める。同定された因子のタグ融合タンパク質を発現させて蛍光顕微鏡観察を行うことでNELF bodiesとの共局在を調べ、さらにNELFのノックダウンにより因子の局在が変化するかを調べる。さらにPBAP法の水平展開を行い、NELF bodies以外の核内構造体についてもSILACプロテオーム解析を行う。
機能面からのアプローチ：当初計画したRFP/GFPデュアルレポーターアッセイ系ではライブラリースクリーニングを進めるのが難しいと判断し、方向転換を余儀なくされたが、選択的ポリ(A)付加により異なるアイソフォームを発現する内在遺伝子に注目し、2つのアイソフォームを二重免疫染色することによりシングルセルレベルで選択的PASを可視化する系を新たに構築することができた。今後はこの系を用いて遺伝学的スクリーニングを行う。ライブラリとしては最新のpooled sgRNAライブラリーを導入済であり、Illuminaプラットフォームで解析予定である。

研究成果

• [国際共同研究] University of Helsinki(フィンランド)
  • 国名: フィンランド
  • 外国機関名: University of Helsinki
• [国際共同研究] Stowers Institute for Medical Research(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Stowers Institute for Medical Research
• [雑誌論文] ARID2 is a pomalidomide-dependent CRL4CRBN substrate in multiple myeloma cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, J., Suwa, T., Murase, Y., Tateno, S., Mizutome, H., Asatsuma-Okumura, T., Shimizu, N., Kishi, T., Momose, S., Kizaki, M., Ito, T., Yamaguchi, Y., and Handa, H.
  • 雑誌名: Nat. Chem. Biol. 巻: 16 ページ: 1208-1217
  • DOI: 10.1038/s41589-020-0645-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genome-wide screening reveals a role for subcellular localization of CRBN in the anti-myeloma activity of pomalidomide (2020)
  • 著者名/発表者名: Tateno, S., Iida, M., Fujii, S., Suwa, T., Katayama, M., Tokuyama, H., Yamamoto, J., Ito, T., Sakamoto, S., Handa, H., and Yamaguchi, Y.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 10 ページ: 4012
  • DOI: 10.1038/s41598-020-61027-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The role of Mediator and Little Elongation Complex in transcription termination (2020)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, H., Ranjan, A., Chen, S., Suzuki, H., Shibata, M., Hirose, T., Hirose, H., Sasaki, K., Abe, R., Chen, K., He, Y., Zhang, Y., Takigawa, I., Tsukiyama, T., Watanabe, M., Fujii, S., Iida, M., Yamamoto, J., Yamaguchi, Y., Suzuki, Y., Matsumoto, M. et al.
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 11 ページ: 1063
  • DOI: 10.1038/s41467-020-14849-1
  • 査読あり / 国際共著
• [備考] 東京工業大学生命理工学院山口研究室
  • URL: http://yamaguchi.bio.titech.ac.jp/
• [産業財産権] 抗骨髄腫剤および抗骨髄腫剤のスクリーニング方法 (2020)
  • 発明者名: 半田宏、伊藤拓水、山口雄輝、日置(山本)淳一
  • 権利者名: 半田宏、伊藤拓水、山口雄輝、日置(山本)淳一
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2020-141689