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2022 年度 実績報告書

極低温超偏極固体NMRによる蛋白質の動的機能構造解析法の開発とGPCRへの応用

研究課題

研究課題/領域番号 20H03193
研究機関大阪大学

研究代表者

松木 陽  大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (70551498)

研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2024-03-31
キーワード動的核偏極(DNP) / 固体NMR / 蛋白質構造アンサンブル
研究実績の概要

最終標的蛋白質のGPCR(β2アドレナリン受容体)について、無細胞系発現・精製・調製法を確立した。DOPC-コレステロール膜リポソームへの再構成、ラジオリガンドアッセイによるリガンド結合活性も確認した。固体NMR試料管へのパッキングを向上するのに、脂質量の最適化が必要であった。リガンドの結合に伴う構造変化を最も反映するヒンジ部位への選択的同位体標識スキームも設計し、主に主鎖構造アンサンブル平衡の観測に供する。これと並行してセレノメチオニン選択標識法も確立し、プロトン観測2次元 77Se-NMR信号の解析から、側鎖の構造アンサンブルに迫るアプローチも実行、学会発表した。GPCR以外の分子系で、やはり構造アンサンブルの動的平衡が機能発現に関与するモデル系として多剤排出系転写因子QacRの発現、精製も行った。QacRの微結晶状試料について、13C相関スペクトルの解析から動的平衡の存在が側鎖信号に捉えられることを見出し、学会発表した。
高次元・残基間相関用のラジオ波パルス列も完成し、観測信号の質向上を目指した最適化を行った。装置の長期・超・安定性を得るために、微小な磁場不均一性を補正するシム電源の改良が必要であることも見出した。
構造アンサンブルの計算科学的解析法については、データベースマイニングに則る基礎的な手法を確立し、モデル系αシヌクレインの液液相分離(LLPS)状態ドロップレット中の構造アンサンブル解析に応用した。成果は複数の学会発表、また論文として公表した。よりGPCRの解析に有用な解析法に発展させるため、DFTに基づく化学シフト計算をデータ解析に直接組み込む改良も行った。
以上より、モデル系、標的蛋白質試料ともに試料調製、DNP-固体NMR測定法、解析法、いずれについても計画に沿って順調に発展させ、膜蛋白質の二重膜中、構造アンサンブル解析の基盤を作った。

現在までの達成度 (段落)

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (13件)

すべて 2022 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (1件) 学会発表 (10件) (うち国際学会 2件、 招待講演 4件) 産業財産権 (1件) (うち外国 1件)

  • [国際共同研究] 米国エネルギー省Ames研究所(米国)

    • 国名
      米国
    • 外国機関名
      米国エネルギー省Ames研究所
  • [雑誌論文] Evolution of α-synuclein conformation ensemble toward amyloid fibril via liquid-liquid phase separation (LLPS) as investigated by dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state MAS NMR2022

    • 著者名/発表者名
      Mika Takamuku, Tomoaki Sugishita, Hajime Tamaki, Lingyingzi Dong, Masatomo So, Toshimichi Fujiwaraa, Yoh Matsuki
    • 雑誌名

      Neurochemistry International

      巻: 157 ページ: 105345

    • DOI

      10.1016/j.neuint.2022.105345

  • [学会発表] 高磁場・極低温DNP-MAS-NMRの装置と方法論2022

    • 著者名/発表者名
      松木 陽
    • 学会等名
      大阪大学蛋白質研究所セミナー
    • 招待講演
  • [学会発表] 細胞内構造生命科学にむけたDNP-MAS-NMRの装置・方法論開発と応用2022

    • 著者名/発表者名
      松木 陽
    • 学会等名
      第61回NMR討論会
  • [学会発表] ナノダイヤモンドを分極剤として用いたDNP-MAS-NMRの生体分子への応用2022

    • 著者名/発表者名
      加藤賢,田巻初,杉下友晃,藤原敏道,松木陽
    • 学会等名
      第61回NMR討論会
  • [学会発表] 極低温MAS-DNP固体NMRによる多剤結合転写因子QacRの構造分布解析2022

    • 著者名/発表者名
      田巻初,藤原敏道,松木陽
    • 学会等名
      第61回NMR討論会
  • [学会発表] 無細胞合成系によるβ2アドレナリン受容体発現とその構造アンサンブルの固体NMR解析2022

    • 著者名/発表者名
      杉下友晃,田巻初,加藤賢,藤原敏道,松木陽
    • 学会等名
      第61回NMR討論会
  • [学会発表] 変調したマイクロ波を用いた動的核偏極効率の向上2022

    • 著者名/発表者名
      張仲良, 松木陽, 藤原敏道
    • 学会等名
      第61回NMR討論会
  • [学会発表] 動的核偏極(DNP)による高感度・高分解能固体NMR法-装置と方法論の開発と応用2022

    • 著者名/発表者名
      松木 陽
    • 学会等名
      Japan Analytical Instruments Active Users Network Symposium
  • [学会発表] Methods and Instruments for High-Field Ultralow Temperature DNP-MAS-NMR2022

    • 著者名/発表者名
      Yoh Matsuki
    • 学会等名
      日印固体NMRシンポジウム
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Conformational Evolution of Alpha-Synuclein in Droplets - an Integrated Study with DNP-Enhanced MAS NMR -2022

    • 著者名/発表者名
      松木 陽
    • 学会等名
      相分離生物物理学研究会
    • 招待講演
  • [学会発表] Conformational Evolution of Alpha-Synuclein in Droplets - an Integrated Study with DNP-Enhanced MAS NMR -2022

    • 著者名/発表者名
      Yoh Matsuki
    • 学会等名
      University of Michigan Zoominar Series, Molecular Basis of Proteinopathies
    • 国際学会 / 招待講演
  • [産業財産権] ナノダイヤモンド型DNP用分極剤およびその製造方法並びに使用方法2022

    • 発明者名
      松木 陽、加藤憲、藤原敏道
    • 権利者名
      松木 陽、加藤憲、藤原敏道
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      PCT/JP2022/031633
    • 外国

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公開日: 2023-12-25  

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