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前年度メダカT1rリガンド結合ドメインへの結合を見出した塩化物イオンについて、変異体解析を行い、結晶構造解析で見られた部位への塩化物イオン結合が、実際にリガンド結合ドメインの構造変化を引き起こすことを立証した。さらに共同研究より、塩化物イオンが種を問わずT1rに作用し、実際にT1rを介して味覚を引き起こすことを明らかにした。
さらに、本研究でこれまでに得られた知見を活かし、現在得られている味物質結合型とは異なるコンフォメーションのT1rリガンド結合ドメイン構造をとらえる複数の試みを行った。第一に、味物質だけではなく、受容体活性化能が判明した塩化物イオンも除去した条件下で、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を行った。種々の試料作成条件検討を行ったが、研究期間内に構造を決定可能な良好な条件を見出すことはできなかった。第二に、金属錯体配位によるコンフォメーション捕捉を目指し、モデルタンパク質を用いた錯体結合状態の結晶構造解析を実施することで、T1rリガンド結合ドメインのコンフォメーション補足に向けての構造的基盤情報を得た。第三に、前年度までに示差走査蛍光測定により見出していた各種新規リガンドについて、結合状態の構造解析を進めた結果、このうちの1つについて、その結合構造がこれまで得られていなかったコンフォメーションをとっていることを見出した。
なお、現在リガンド結合解析に用いている示差走査蛍光測定条件は、膜貫通領域を含む試料には適用できないため、今後の全長受容体解析に向け、モデル膜タンパク質を用いたGFPサーマルシフトアッセイ系確立を行った。さらに、前年度に続き、T1rの膜貫通領域のリガンド結合構造とそのダイナミクスを共同研究によりインシリコ解析し、変異体解析による検証を行った結果、各リガンドが示す作用に重要な残基を見出した。
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