| 研究課題/領域番号 |
20H03214
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
土屋 光 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 主任研究員 (90760132)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | タンパク質分解 / プロテアソーム / ユビキチンリガーゼ |
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| 研究実績の概要 |
ユビキチン・プロテアソーム系は選択的なタンパク質分解を実行することで様々な生命現象を制御している。従来、ユビキチン化された基質タンパク質はプロテアソームに直接認識され分解されると信じられてきたが、プロテアソームと一過的に相互作用する様々な相互作用タンパク質群がプロテアソームの分解サイクルを正負に制御することが徐々にわかってきた。研究代表者はプロテアソームと相互作用するタンパク質群の網羅的解析によりユビキチンリガーゼE6APなどの複数の疾患関連ユビキチンリガーゼがプロテアソームと相互作用すること、さらに、E6AP（別名UBE3A: アンジェルマン症候群・自閉症の責任遺伝子、さらに子宮頸がんに関与）がRpn10（ユビキチン受容体）の機能未知ドメインに相互作用することを見出した。本研究ではプロテアソーム結合性ユビキチンリガーゼが、どのようにプロテアソーム依存的なタンパク質分解を制御するのか？を明らかにし、さらに疾患との関連性を明確にする。本年度はE6APがプロテアソーム分解に与える影響をタンパク質およびユビキチン化タンパク質の変動を網羅的に同定・定量することによりプロテアソーム上での基質選択性を検討した。また、プロテアソーム上のユビキチン化基質への影響を検討したが、E6APノックダウン細胞時にプロテアソームと相互作用するユビキチン化基質の変化がみられなかった。そこで、プロテアソーム結合性ユビキチンリガーゼのストレス応答性を検討した。この結果、E6APが新生不良タンパク質のユビキチン化に関与することを明らかとした。現在プロテアソーム結合能との関連を解析している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は細胞内におけるE6APのプロテアソーム上での機能解析を実施した。E6APノックダウン細胞からプロテアソームを精製し、プロテアソームと相互作用するユビキチン化基質の変動を解析したが、通常状態でコントロールと比較し差がみられなかった。そこでストレス（タンパク質毒性ストレス）刺激によりプロテアソーム経路に負荷を与えた状態で検討したところ、E6APのノックダウンにより不溶性画分でのユビキチン化タンパク質が蓄積することを見出せたから。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、ストレス存在下でのプロテアソーム結合ユビキチンリガーゼの機能解析を実施する。
ストレス環境下における変動解析
神経変性疾患などの疾患ではプロテアソーム結合性ユビキチンリガーゼの変異によりプロテアソーム経路に負荷がかかっていることが示唆される。そこで、タンパク質毒性や酸化ストレス刺激下におけるタンパク質凝集体形成能を検討する。具体的にはコントロール、およびE6APノックダウン細胞にタンパク質毒性ストレスを与え細胞を界面活性剤可溶性、不溶性に分画する。それぞれの分画のユビキチン化タンパク質や新合成タンパク質の変動を検討する。変動がみられたら、UBE3A WT, ユビキチンリガーゼ活性変異体、プロテアソーム結合能欠損変異体の入れ戻し実験を実施する。また、プロテオミクス解析を実施し、プロテアソーム相互作用因子の変動を検討する。
ユビキチンリガーゼ活性制御因子の探索
プロテアソーム上でＥ6APの機能を調節する新規因子の同定を試みる。プロテアソームと相互作用因子との結合は一過的であるため、従来のIPMS法（免疫沈降物の質量分析解析）では同定が困難である。そこで、クロスリンク-IP-MS法により、プロテアソームと一過的に相互作用するタンパク質群を網羅的に同定する。重要な新規タンパク質が同定された場合は、試験管内再構築系を用いてE6APとの機能連携を検討する。
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