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2021 年度 実績報告書

細胞膜張力と膜タンパク質機能の関連解明に向けた基盤実験技術の創成と応用

研究課題

研究課題/領域番号 20H03219
研究機関福井大学

研究代表者

岩本 真幸  福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40452122)

研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2024-03-31
キーワード生体膜 / チャネル / 張力
研究実績の概要

研究開始当初より開発を進めてきた膜張力実験プラットフォームにリアルタイム張力解析プログラムを組み合わせて進化させた。これにより、脂質二重膜(CBB)張力の常時モニター下で膜張力操作を行い、CBBに再構成したKcsAチャネルの応答を観測できるようになった。従来は実験後のデータ解析によって初めて膜張力値が明らかになっていたが、その場で望んだ通りの張力に制御できるようになり、実験効率が著しく向上した。また、脂質二重膜の片面ごとに張力を制御する非対称張力実験を行い、KcsAの張力依存性が細胞質側張力によってもたらされていることが明らかになった。KcsAの構造に与える非対称張力の影響を検証するために、テトラメチルローダミン(TMR)標識による蛍光測定実験を行った。この実験は、KcsAの特定部位に標識したTMRの蛍光強度がKcsAのゲート開閉に伴う構造変化によって変化することを利用したものである。TMR標識KcsAをリポソームに再構成し、直径の小さいリポソームを調製することで膜に非対称張力を発生させた。KcsAはリポソーム膜に細胞質側を外側に向けて組み込まれているので、上記リポソームではKcsAの細胞質側リーフレットの張力が大きくなる。蛍光測定の結果、小径(約30 nm)のリポソーム膜内ではTMR標識KcsAの蛍光強度が有意に変化しており、ゲート構造に対する細胞質側張力の影響を確認できた(Ueki, FEBS Lett., 2021)。TMR標識とリポソーム径制御による構造変化解析は、機能解析(電流測定)データをサポートできるので、今後変異体の解析を行う際にも活用したい。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

膜実験プラットフォームを初年度よりも進化させることができた。また、膜張力がタンパク質構造に及ぼす影響を解析する手法を確立させ、膜張力の作用を多面的捉えられる研究体制が整った。さらに、KcsAチャネルの膜張力感知機構に関し、上述の手法を応用することで新たな知見を得ることができた。

今後の研究の推進方策

膜張力実験プラットフォームの開発は概ね完了したので、今後はチャネル研究への応用可能性の実証に注力する。具体的には、KcsAチャネルが膜張力依存性を示す構造的要因を明らかにする。そのために複数種の変異体KcsAを作製し、膜張力のリアルタイム制御下で単一チャネル電流測定を行う。また、標識したTMRの蛍光強度から張力によるチャネル構造変化を検出する実験手法も活用し、膜張力作用を機能および構造の両面から捉える。

  • 研究成果

    (13件)

すべて 2022 2021 その他

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Binding of cardiolipin to the KcsA channel at the membrane outer leaflet allosterically opens the inner gate2022

    • 著者名/発表者名
      Inada Masataka、Iwamoto Masayuki、Yoshida Norio、Oiki Shigetoshi、Matsumori Nobuaki
    • 雑誌名

      bioRxiv

      巻: - ページ: -

    • DOI

      10.1101/2022.02.08.479071

    • オープンアクセス
  • [雑誌論文] 膜タンパク質特性の検査台としての人工細胞膜2022

    • 著者名/発表者名
      岩本真幸
    • 雑誌名

      細胞

      巻: 54 ページ: 200-203

  • [雑誌論文] Fluorescent labeling in size‐controlled liposomes reveals membrane curvature‐induced structural changes in the KcsA potassium channel2021

    • 著者名/発表者名
      Ueki Misuzu、Iwamoto Masayuki
    • 雑誌名

      FEBS Letters

      巻: 595 ページ: 1914~1919

    • DOI

      10.1002/1873-3468.14141

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Geometrical and electrophysiological data of the moving membrane method for the osmotic water permeability of a lipid bilayer2021

    • 著者名/発表者名
      Yano Keita、Iwamoto Masayuki、Koshiji Takaaki、Oiki Shigetoshi
    • 雑誌名

      Data in Brief

      巻: 38 ページ: 107309~107309

    • DOI

      10.1016/j.dib.2021.107309

    • 査読あり
  • [学会発表] チャネル形成ペプチドpolytheonamide Bと膜との相互作用2022

    • 著者名/発表者名
      松木悠佳、高島政子、岩本真幸、老木成稔
    • 学会等名
      生理研研究会「細胞の局所コミュニティ研究会」
  • [学会発表] 蛍光標識による KcsAカリウムイオンチャネルの膜曲率依存的な構造変化の評価2022

    • 著者名/発表者名
      植木美鈴、岩本真幸
    • 学会等名
      第99回日本生理学会大会
  • [学会発表] イオン透過性を持つアクアポリン6の膜再構成法によるゲーティング特性の解析2022

    • 著者名/発表者名
      真木孝尚、老木成稔、岩本真幸
    • 学会等名
      第99回日本生理学会大会
  • [学会発表] KcsAカリウムチャネルのチャネル活性と脂質2重膜の膜厚の関係2022

    • 著者名/発表者名
      松木悠佳、岩本真幸、高島政子、老木成稔
    • 学会等名
      第99回日本生理学会大会
  • [学会発表] Fluorescence detection of membrane curvature-induced structural changes in the KcsA potassium channel2021

    • 著者名/発表者名
      植木美鈴、岩本真幸
    • 学会等名
      日本生物物理学会第59回年会
  • [学会発表] Analysis of water permeability of human Aquaporin6 using moving membrane method2021

    • 著者名/発表者名
      真木孝尚、老木成稔、岩本真幸
    • 学会等名
      日本生物物理学会第59回年会
  • [学会発表] Formation of vertical lipid bilayers in nanofluidic channels by contact of reverse micelles2021

    • 著者名/発表者名
      Kawagishi H, Oiki S, Iwamoto M, Xu Y
    • 学会等名
      The 25th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences
    • 国際学会
  • [学会発表] ナノ流路内逆ミセル接触による脂質二重膜の垂直形成と測定2021

    • 著者名/発表者名
      川岸啓人、老木成稔、岩本真幸、許岩
    • 学会等名
      化学とマイクロ・ナノシステム学会 第44回研究会
  • [備考] 福井大学医学部分子神経科学HP

    • URL

      https://www.med.u-fukui.ac.jp/laboratory/molecular-neuroscience/

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公開日: 2022-12-28  

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