| 研究課題/領域番号 |
20H03275
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
西浜 竜一 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 教授 (70283455)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Raf様キナーゼ / 光合成 / シグナル伝達 / 糖代謝 / ゼニゴケ |
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| 研究実績の概要 |
PRAF顆粒の実体解明に向け、PRAF-mCitrine/praf株のタイムラプス観察を行ったところ、PRAF顆粒はブラウン運動様に動くものの、長距離には移動しないという挙動を示すことがわかった。
PRAF-3xFLAG/praf株を用い共免疫沈降実験を行い、質量分析によりPRAF結合タンパク質の同定を試みた。3回の実験で、非形質転換体と比較して有意に結合が見られたものとしてsmall subunit ribosomal proteinが同定されたが、これが真の相互作用因子かどうかは慎重に見極める必要がある。
PRAFのPB1ドメインの機能解析を行った。まず、PB1ドメインをもつゼニゴケの18タンパク質（PRAFを除く）のうち、13個についてPRAFとの相互作用を酵母Two-hybrid法で調べたところ、どのタンパク質のPB1ドメインとも相互作用を示さなかった。次に、prafノックアウト株の表現型を、PB1ドメインを欠失させた変異体（PRAFdPB1）が相補できるか調べたところ、相補は部分的であった。また、PRAFdPB1タンパク質においては光合成依存的なリン酸化が起こらなくなることが示された。さらに、PB1ドメイン同士の静電的相互作用に重要と考えられる負の電荷をもつOPCAモチーフや正の電化をもつリジン残基に点変異を導入したところ、PRAFの機能やリン酸化が弱くなった。以上のことから、PB1ドメインを介したホモ多量体化が、PRAFの機能において重要な働きを担っていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
コロナ禍の影響で技術補佐員を雇用することができなかった。また研究協力者も研究室に来ることが制限された。そのため、実験を計画通りに進めることができず、多くの経費を翌年度に繰り越した。
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| 今後の研究の推進方策 |
PRAFの顆粒局在にPB1ドメインが関与するかどうか調べるとともに、その顆粒の実体解明を進める。また、顆粒形成が光合成依存的かどうか調べる。
praf変異体を用いたリン酸化プロテオーム解析データを、これまでと異なるプログラムで新たに解析し直し、PRAF依存的に光合成刺激によりリン酸化を受けるタンパク質を抽出していく。
TORやSnRK1との関係について解析をすすめるともに、キナーゼアッセイを行っていく。
シロイヌナズナのPRAFホモログの変異体を入手、あるいは作出し、表現型解析を行う。
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