| 研究課題/領域番号 |
20H03289
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
桧垣 匠 熊本大学, 大学院先端科学研究部, 准教授 (90578486)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 気孔開閉運動 / 微小管 / 膜小胞 / イメージング / 画像解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、多次元ライブセルイメージングと機械学習を活用した画像解析技術に基づいて、植物の気孔開閉運動を司るH+-ATPaseの細胞膜への局在化（細胞膜輸送）機構の全貌解明を目指す。気孔開口を駆動するH+-ATPase AHA1の細胞膜輸送に必須の因子であるPATROL1およびその相互作用因子群に注目し、それらの三次元分布および共局在性を多次元ライブセルイメージングにより描出する。取得画像群から膜小胞と微小管を高精度に検出・評価する機械学習技術を活用した定量的細胞生物学研究を展開し、気孔応答を制御するPATROL1依存的なAHA1の細胞膜輸送機構を明らかにする。
今年度は、PATROL1、微小管、PATROL1相互作用候補因子（膜交通関連因子）の細胞内動態をスピニングディスク式共焦点顕微鏡により画像取得した。取得画像から、機械学習を援用した画像解析を介して小胞の密度や微小管の配向、揃い具合、長さなどの特徴量を計測するとともに、これらの共局在性を定量的に評価した。また、膜交通関連因子を秒オーダーでの経時観察したところ、細胞膜近傍における膜小胞の滞在時間や、膜小胞に局在する順序に違いが観察された。そこで、多色動画像を取得し、滞在時間と局在順序に関しても定量評価を行った。
技術的な検討として、微小管構造の定量評価のためのセグメンテーションに関して、既存の閾値設定による手法と深層学習を活用した手法の比較検証を実施した。その結果、微小管の配向や揃い具合については両者に大きな差異は認められなかったが、密度に関しては深層学習に基づくセグメンテーションを介した方が精度が高いことが判明した（堀内ら 未発表）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
今年度も新型コロナウイルス感染症流行のため出張等の研究活動が一部制限された時期があったが、研究室における感染対策（密を防ぐために研究室の各部屋で実験・解析が完結するようにレイアウト変更、オンラインミーティングツールの積極的な活用など）も効果的であり、本研究への影響は限定的であった。
計画時に予想していなかった展開として、深層学習を援用した細胞骨格のセグメンテーション方法の検討について大きな進捗があり、これが本研究の推進、特に阻害剤を用いて微小管の密度を変化させた場合の膜小胞の動態解析に極めて有用であることが判明した。
また、本研究に関わる論文も順調に発表できており（Sato et al. 2021, Suzuki et al. 2021, Sakai et al. 2022）、本研究は当初の計画以上に進展していると判断される。
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| 今後の研究の推進方策 |
「現在までの進捗状況」で述べたように、現在の社会情勢を鑑みるとオンラインを活用した研究環境の構築は研究を滞りなく遂行する上で今後も重要と考える。引き続き、感染対策を前提とした研究体制を整える。
本研究の最終年度に当たる来年度は、本研究の目標であったH+-ATPase AHA1の細胞膜輸送の各工程（例えば、細胞内運動、ドッキング、プライミング、膜融合など）における各因子の時間空間的な寄与の推定を目指す。また、得られた研究成果を論文として発表する。
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