| 研究課題/領域番号 |
20H03374
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
三枝 大輔 帝京大学, 薬学部, 准教授 (90545237)
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| 研究分担者 |
可野 邦行 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (50636404)
松本 洋太郎 東北大学, 薬学研究科, 講師 (90420041)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | S1P / MALDI / MSイメージング / 質量分析計 / スフィンゴ脂質 |
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| 研究実績の概要 |
生理活性脂質であるスフィンゴシン一リン酸 (S1P) は、免疫疾患、がんや動脈硬化の発症に関連することが示唆されており、S1P シグナル伝達系に発現する分子が創薬標的になり得ると考えられている。S1P は特定の組織に局在する可能性が示唆されているが、現在までの解析手法では、S1Pの組織分布を可視化することが困難であった。そこで本研究の目的は、S1Pに関わるスフィンゴ脂質代謝物を対象とし、一細胞以下のレベルで組織切片上に分布するS1Pを可視化できる質量分析イメージング（MSイメージング）法を開発することである。これに加え、開発した手法を病態モデル動物に応用し、 S1Pシグナル伝達機構の変化がもたらすS1Pとスフィンゴ脂質代謝関連分子群の機能解析を実施することにより、創薬標的を明らかにすることである。
令和3年度は、2年度の研究成果を踏まえ、引き続きS1P特異的な検出法の開発と、高感度かつ高分解能組織切片MSイメージング法の開発を実施した。具体的には、分担研究者の可野博士のグループとの共同で開発したPhostagによるS1P特異的誘導体化法について、更なる高感度化を目指し、分担研究者の松本博士のグループと協力して新規Phostag誘導体化試薬の合成を実施した。また、新たに青木順（大阪大学）博士の協力を得ることで、投影型MSイメージングによるナノスケールの空間分解能での組織切片解析を実施した。さらには、可野博士のグループが所有する最新型のイオンモビリティ技術を搭載したCyclicIMSを用い、機能的なスフィンゴ脂質と一種である糖セラミドの組織切片イメージングにも挑戦した。令和3年度は、所属変更に伴い研究の進捗が遅れる可能性があったが、大きな研究成果が得られたため、概ね順調に進行していると考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和2年度の成果において、我々が合成したPhostagは、S1Pを高感度に検出できることが判明したが、置換基を導入したPhostag誘導体化試薬は、合成純度等の影響などにより、S1Pを高感度に検出することができなかった。そこで令和3年度は、合成純度の向上に向けた有機合成プロセスを見直すことで、高純度なPhostag誘導体化試薬を独自に合成することに成功し、MALDI-MS解析によりS1Pが2倍程度高感度に検出することができた。また、一細胞以下のレベルでの高感度可視化に向けて青木博士との共同研究を開始し、独自に開発した導電性粘着フィルムを活用し、マウス全身組織を採取後、投影型MALDI-MSイメージングに供した。その結果、比較的低分子領域のシグナルが検出され、現在分子の同定を行っているが、投影型MSイメージング装置は、ナノスケールでの可視化へ有用な可能性が示唆された。また我々は、S1Pの機能解明に向け、スフィンゴ脂質代謝全体についてMSイメージングで捉えられるかどうかについても検討を始めている。スフィンゴシンやセラミドは、高分解能型による解析であればMSイメージングによる検出は容易であるが、糖脂質のように、異性体が存在する生理活性脂質を分離分析なしにMSイメージングすることは極めて困難であった。我々は、可野グループの所有する最新型のイオンモビリティを搭載したCyclicIMSを駆使することにより、糖セラミドの分離および可視化に成功した。本成果は現在論文投稿準備中であるが、疾患モデル動物におけるスフィンゴ脂質代謝変動を解析する上で極めて有用であることに加え、S1Pの代謝制御解明に向けて大きな研究発展であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度に、独自に合成したPhostag誘導体化試薬に加え、現在も複数種のPhostag誘導体化試薬を有機合成している。従って最終年度は、MALDI-MSイメージングに新たに合成した試薬を加えたPhostag誘導体化試薬を用い、組織切片上におけるS1Pの高感度可視化実験を実施する。また、多種有機合成したPhostag誘導体化試薬は、S1Pのみならず多くのリン酸基を有する低分子化合物のMALDI-MS分析に有用であると考えられるため、Phostag誘導体化試薬ライブラリーを構築する。投影型MSイメージングによるナノスケールでの組織切片上でのS1P可視化に向け、動物モデル等に新規Phostag誘導体化試薬を用いた解析を実施する。また、投影型MSイメージングは、青木博士が独自に製作した装置であるため、レーザーや検出条件の最適化も可能であることから、Phostagで誘導体化されたS1P検出領域に絞ることで、最終的に細胞レベルで高感度にS1Pを可視化することに挑戦する。さらには、新たに導入したCyclicIMSを駆使し、S1Pのみならず、スフィンゴ脂質代謝関連分子群を網羅的かつ異性体分離可能な高感度MSイメージング法の開発に挑戦し、病態モデル動物を用いたS1Pの可視化に加え、スフィンゴ脂質代謝関連分子の変動も一網打尽に検出することで、新たな創薬標的分子の創出を目指す。
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