| 研究課題/領域番号 |
20H03377
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
安達 基泰 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学領域, 上席研究員(定常) (60293958)
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| 研究分担者 |
岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (10247968)
高橋 知里 同志社女子大学, 薬学部, 特任助手 (70833680)
老川 典夫 関西大学, 化学生命工学部, 教授 (80233005)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | neutron / crystal / protein / hydrogen / drug |
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| 研究実績の概要 |
１、human Dihydrofolate Reductase (hDR)に関しては、hDの人工遺伝子を合成し、大腸菌発現系の構築を進めた。独自の可溶性HisTagを用いて大腸菌発現系を改良したところ、hDの大量発現を確認した。さらに、得られた発現系を用いて、hDを高純度に精製に成功することができた。
２、human Monoamine Oxidases (hMO)について、大腸菌発現系の構築と、中性子結晶構造解析に必要な大型結晶の作製に取り組む計画である。hMOの人工遺伝子を合成し、大腸菌発現系の改良を進めた。独自の可溶性HisTagを用いて大腸菌発現を試みたところ、hMOの大量発現に至ってはいない。ただし、中性子構造解析をすすめるには、得られている量が少量ではあるが、精製品を取得することができた。
３、human Cytochrome P450 2D6 (2D6)創薬標的酵素においても、独自の可溶性HisTagを用いて大腸菌発現を試みた。2D6に関しては、N末端とC末端の両者にHisTagを付加したところ、C末端がより発現レベルが高く、有用であることが判明した。
４、Amino acid Racemase (AR)においても、人工遺伝子を合成し、大腸菌発現系の構築を進めた。ARに関しては、微生物由来の酵素であることから、比較的大量発現が容易であると考えられるが、Ser/Thrキナーゼに注力した。阻害剤複合体の中性子解析に向けて複合体結晶を作製し、独自の可溶性HisTagの効果もあって、予想通り大量発現に成功した。
５、human DOPA decarboxylase (DDC)においても、人工遺伝子を合成し、大腸菌発現系の構築を進め、DDCを高純度に精製に成功することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究での成果創出のためには、均一性が高く高純度のタンパク質試料の調製が要となる。R2年度は、予定通り遺伝子を人工合成し、大腸菌発現系の構築をすすめた。その結果、5種すべてのタンパク質に関して、可溶性タンパク質としての発現を確認することができた。hMO、2D6、DDCの3種については、中性子結晶構造解析用の大型結晶を作製するためには、発現レベルが低いが、可溶性タンパク質としての発現が確認され、hMOとDDCに関しては、精製品を取得したことが大きな進展と言える。以上のことより、おおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
１、hDの大量発現に成功したことから、タンパク質試料を精製し、ITC(等温滴定カロリーメトリー)を用いた相互作用解析や、NADPH/阻害剤/hDRの3者複合体のX線構造解析をすすめる。
２、hMOに関しては、タンパク質の発現レベルが十分でないことから、シャペロンとの共発現や、分子量の大きめのオリジナルな可溶性Tagのさらなる付加によって、可溶性発現の効率を向上させる。分子量の大きめのオリジナルな可溶性Tagを使った場合は、構造形成できていない試料の混在が懸念されることが経験的にわかっているため、酵素の活性測定により、構造形成を確認する。
３、2D6については、タンパク質試料の安定性が低いことから、バッチ法を用いた迅速な精製法の確立をすすめる。得られた試料を用いて、活性測定にくわえ、ITCやBiacoreを用いた相互作用解析を実施し、さらにデューテトラベナジン(D体)およびテトラベナジン(H体)とのX線結晶構造解析を実施することで、相互作用を詳細に明らかにする。
４、ARついては、得られている大量発現系を使い、中性子結晶構造解析のためのタンパク質試料調製と大型結晶の作製をすすめる。
５、DDCにおいては、ｈMOと並行して、シャペロンとの共発現や、分子量の大きめのオリジナルな可溶性Tagのさらなる付加によって、可溶性発現の効率を向上させる。
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