p62変異による液－液相分離異常の微細形態とその分子基盤

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20H03415
• 研究機関: 福島県立医科大学
• 研究代表者: 和栗 聡 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (30244908)
• 研究分担者: 田村 直輝 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (70745992)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 液-液相分離 / オートファジー / 高浸透圧 / p62 / ストレス顆粒 / 乳癌

研究実績の概要

（１）各種p62変異とp62液滴の関係性：電子顕微鏡観察に加えて粘性プローブを用いた解析に着手した。共同研究者より開発中のプローブを供与頂き、これをHalo-Tagシステムを用いてU2OS細胞に発現させ、蛍光寿命を指標に細胞質中の粘性を評価した。その結果、0.4 Mショ糖の添加による蛍光寿命の差を検出できた。今後、Halo-Tag-p62タンパクとして発現させ、p62液滴の粘性情報を追加して解析を進める予定である。
（２）高浸透圧ストレス下におけるp62液滴とストレス顆粒の動態の比較：高浸透圧下においてp62液滴はストレス顆粒とは別個の構造として形成され、隔離膜を伴うものが多かった。また、p62液滴はオートファジーで分解されるがストレス顆粒は分解されなかった。以上より、高浸透圧下におけるp62液滴の特殊性が明らかになった。
（３）p62 関連タンパク質群の関与について：高浸透圧下では、p62液滴にユビキチン鎖（K48鎖およびK63鎖）が共局在すること、他のオートファジーレセプターであるNBR1とTAX1BP1も共局在して分解されることが明らかになった。
（４）p62液滴形成を制御する新規タンパク質の探索：p62液滴を介したオートファジー分解の基質としてユビキチン化タンパク質の探索を行った。膀胱癌由来T24細胞の細胞抽出液からPTMscanによりユビキチン化タンパク質を精製し、質量分析計により同定した。いくつかの興味深い分子が同定できたため、次年度に解析を進める予定である。
（５）癌組織におけるp62液滴の解析：乳癌113症例の組織について免疫組織化学法によりp62顆粒の有無を解析したところ、細胞増殖の指標となるKi-67との相関関係を認めた。以上の結果より、p62が細胞増殖能を予測するマーカーとなる可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初は変異p62を有する液滴の電子顕微鏡解析について、p62液滴の電子密度を指標として進める予定であった。しかし、電子密度の差はわずかであること、発現レベルや細胞の状態で変わり得ること、そして共同研究者のグループより筋萎縮性側索硬化症に関連するp62変異についてp62液滴の細胞生物学的な研究が報告された（Faruk et al., JBC, 2021）ことにより、研究の方向性を一部変更することとした。すなわち、（１）液滴の性状を評価する新たな手法として粘性プローブを用いた実験を進め、また（２）当研究グループが明らかにした高浸透圧ストレス下におけるp62液滴の生成・分解に関する研究を優先し、その論文化および関連する新規タンパク質の解析を進めた。概要欄にはこれら結果を記載した。
また、乳癌におけるp62液滴の免疫組織学解析の成果については、学会発表の準備および論文化を開始したところである。

今後の研究の推進方策

高浸透圧ストレス下に生成されるp62液滴とストレス顆粒との比較解析について論文化を見据えた各種実験を進める。具体的には2種類の液滴について（１）粘性プローブを用いた液滴の評価、（２）ライブセルイメージングによる液滴の性状解析、（３）各種p62変異をもつp62液滴の挙動変化と微細形態変化、（４）p62液滴形成・分解における基質タンパク質の機能解析などを推進し、CLEM解析を推進する。また、（５）培養細胞を用いた実験のみならずオルガノイドなどの多細胞系モデルを用いたの実験も進めていく予定である。
疾患への応用としては、乳癌におけるp62顆粒と細胞増殖能の正の相関について症例数を増やすと共に各種生化学実験を追加して仮説を補強しながら論文化を進める。

研究成果

• [雑誌論文] Loss of Atg2b and Gskip Impairs the maintenance of the hematopoietic stem cell pool size. (2022)
  • 著者名/発表者名: Shun-Suke Sakai, Atsushi Hasegawa, Ryosuke Ishimura, Naoki Tamura, Shun Kageyama, Satosko Komatsu-Hirota, Manabu Abe, Yiwei Ling, Shujiro Okuda, Manabu Funayama, Mika Kikkawa, Yoshiki Miura, Kenji Sakimura, Ichiei Narita, Satoshi Waguri, Ritsuko Shimizu, Masaaki Komatsu
  • 雑誌名: Molecular and Cellular Biology 巻: 42 ページ: e0002421
  • DOI: 10.1128/MCB.00024-21
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Clathrin adapters AP-1 and GGA2 support expression of epidermal growth factor receptor for cell growth. (2021)
  • 著者名/発表者名: Takefumi Uemura, Takehiro Suzuki, Naoshi Dohmae, Satoshi Waguri
  • 雑誌名: Oncogenesis 巻: 10 ページ: 80
  • DOI: 10.1038/s41389-021-00367-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Arf GTPase-activating proteins SMAP1 and AGFG2 regulate the size of Weibel-Palade bodies and exocytosis of von Willebrand factor (2021)
  • 著者名/発表者名: Asano Watanabe, Hikari Hataida, Naoya Inoue, Kosuke Kamon, Keigo Baba, Kuniaki Sasaki, Rika Kimura, Honoka Sasaki, Yuka Eura, Wei-Fen Ni, Yuji Shibasaki, Satoshi Waguri, Koichi Kokame, Yoko Shiba
  • 雑誌名: Biology Open 巻: 10 ページ: bio058789
  • DOI: 10.1242/bio.058789
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 哺乳類細胞におけるSQSTM1/p62液滴の形成と分解 (2022)
  • 著者名/発表者名: 和栗 聡、田村 直輝
  • 学会等名: 第127回日本解剖学会総会・全国学術大会
  • 招待講演
• [学会発表] ピースミールマイトファジー隔離膜形成プロセスの微細形態学的解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 荒井 律子、山下 俊一、杉崎 達也、Wu Huajui、神吉 智丈、和栗 聡
  • 学会等名: 第44回日本分子生物学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] Recycling endosome-localized clathrin adaptors AP-1 and GGA2 regulate cell surface expression of EGFR for cell growth (2021)
  • 著者名/発表者名: 植村 武文、和栗 聡
  • 学会等名: 第80回日本癌学会学術総会
• [学会発表] ピースミールマイトファジー隔離膜構築プロセスの電子顕微鏡解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 荒井 律子、山下 俊一、杉崎 達也、Wu Huajui、神吉 智丈、和栗 聡
  • 学会等名: 日本解剖学会第67回東北・北海道連合支部学術集会
• [備考] 福島県立医科大学 解剖・組織学講座
  • URL: https://www.fmu.ac.jp/home/anatomy2/