自己免疫疾患・アレルギー疾患の病態を制御するTIM分子の機能解明

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20H03472
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 秋葉 久弥 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (60338316)
• 研究分担者: 原田 紀宏 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10465065) ; 安倍 能之 順天堂大学, 医学部, 助教 (10647027) ; 多田 昇弘 順天堂大学, 大学院医学研究科, 先任准教授 (50338315)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 免疫学 / 炎症 / 喘息 / アレルギー疾患 / 自己免疫疾患

研究実績の概要

私達はこれまでの研究を通じて、細胞膜外で切断される遊離型TIM-4(sTIM-4)の存在を発見し、炎症細胞に発現するLMIR5と結合して、関節炎モデルマウスや喘息モデルマウスの病態形成に深く関わることを明らかにしてきた。そこで本研究は、疾患によってTIM-4を発現する細胞の種類によって炎症の慢性化に特徴的な違いがあるか検討するため、マウスsTIM-4の切断部位を同定し、これを変異させた非遊離型TIM-4マウスを作製して、各種疾患モデルにおける特徴的な機能の違いを検証することを目的とした。また炎症の定量化を目指し、ヒトsTIM-4を高感度に測定する方法を確立し、喘息患者さんなどの血清からヒトsTIM-4を測定して、発症や病態との相関を検討して臨床応用に向けた基盤を構築することも目的とした。
これまでに新たにラット抗ヒトTIM-4モノクローナル抗体を作製して、ヒトsTIM-4を高感度に測定することができるサンドイッチELISA法を構築した。順天堂医院膠原病・リウマチ内科、及びバイオリソースバンク活用研究支援講座と連携を取り、順天堂大学医学系研究等倫理委員会承認のもと、膠原病患者さん（関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎/皮膚筋炎）と健常者から採取された血清中のsTIM-4を測定して、それぞれの疾患の間に差異があるか否か解析を行った。
またsTIM-4の切断部位を同定するために、TIM-4-PA/ pCD-PAx3と抗PA抗体-ビーズを用いて切断後に細胞に結合した状態のTIM-4-PAを回収、液体クロマトグラフィー質量分析計を用いてsTIM-4の切断部位の同定を試みたが、タンパク質の回収量が少なかったことから十分な計測ができていない。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

順天堂医院膠原病・リウマチ内科、及びバイオリソースバンク活用研究支援講座と連携を取り、順天堂大学医学系研究等倫理委員会承認のもと、関節リウマチ118例、それ以外の膠原病患者血清としてシェーグレン症候群94例、全身性エリテマトーデス140例、全身性強皮症52例、多発性筋炎12例から血清sTIM-4を測定した。結果、検討したすべての膠原病患者血清中のsTIM-4は、健常者血清中のsTIM-4と比較して有意に高値を示した。中でも関節リウマチ患者の血清sTIM-4量は、他の膠原病患者の血清sTIM-4値よりも有意に高値を示した。この結果は、先に報告した関節リウマチモデルマウスの症状悪化とともに、血清sTIM-4が見出された結果と同様に、ヒトの関節リウマチ患者の血清中にもsTIM-4が存在することを確認したことになる。また関節リウマチの活動性の指標として用いられている、マトリックスメタロプロテアーゼ-3(MMP-3)とC反応性蛋白(CRP)と弱いながらsTIM-4は有意な相関を示した。このことからsTIM-4はCRPやMMP-3と同様に疾患活動性の補助的なサロゲートマーカーになるのではないかと考えている。
またsTIM-4の切断部位を同定するために、TIM-4-PA/pCD-PAx3ベクターをHEK293T細胞に導入、72時間後に細胞を溶解。細胞溶解液中に存在する切断後のTIM-4-PAを抗PA抗体-ビーズを用いて免疫沈降により回収。液体クロマトグラフィー質量分析計を用いてsTIM-4の切断部位を同定する予定でいたが、十分な量のタンパク質が得られず計測できずにいる。この問題を解決すべく、HEK293T細胞へのTIM-4-PA/pCD-PAx3ベクターの導入効率を高める条件検討を行っている。

今後の研究の推進方策

関節リウマチ患者血清中のsTIM-4値が健常者と比べ有意に高かったことから、さらに関節リウマチ患者の疾患活動性との比較や合併症の有無による違い、あるいは治療薬投与による違いについて検討を行う予定でいる。
sTIM-4の切断部位を同定する最大の障壁は、液体クロマトグラフィー質量分析計による解析に必要なタンパク質量の確保にある。これまで方法を変え試してきたが、細胞膜上に発現する全てのTIM-4が切断されるわけではなく、むしろ切断されるTIM-4量は少ない可能性がある。HEK293T細胞へのTIM-4-PA/pCD-PAx3ベクターの導入効率を上げる一方で、スケールを大きくしてより量に特化する必要もあると考えている。
またTIM-4発現制御に関わる転写調節因子を見出すとともに、免疫組織染色に使用可能な抗マウスTIM-4抗体を作製する予定である。作製したTIM-4抗体を用いて免疫組織染色を行い、関節炎モデルマウスの関節組織や喘息モデルマウスの肺病理組織における、これら分子の発現の局在を解析する。

研究成果

• [国際共同研究] The Washington University/University of Pittsburgh/University of Wisconsin(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: The Washington University/University of Pittsburgh/University of Wisconsin
  • 他の機関数: 1
• [国際共同研究] Pusan National University(韓国)
  • 国名: 韓国
  • 外国機関名: Pusan National University
• [雑誌論文] Gasdermin D-mediated release of IL-33 from senescent hepatic stellate cells promotes obesity-associated hepatocellular carcinoma. (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamagishi R, Kamachi F, Nakamura M, Yamazaki S, Kamiya T, Takasugi M, Cheng Y, Nonaka Y, Yukawa-Muto Y, Thuy LTT, Harada Y, Arai T, Loo TM, Yoshimoto S, Ando T, Nakajima M, Taguchi H, Ishikawa T, Akiba H, Miyake S, Kubo M, Iwakura Y, Fukuda S, Chen WY, Kawada N, Rudensky A, Nakae S, Hara E, Ohtani N
  • 雑誌名: Sci Immunol 巻: 7 ページ: eabl7209
  • DOI: 10.1126/sciimmunol.abl7209.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of Japanese Cedar Pollen Sublingual Immunotherapy on Asthma Patients with Seasonal Allergic Rhinitis Caused by Japanese Cedar Pollen. (2022)
  • 著者名/発表者名: Ueda S, Ito J, Harada N, Harada S, Sasano H, Sandhu Y, Tanabe Y, Abe S, Shiota S, Kodama Y, Nagaoka T, Makino F, Chiba A, Akiba H, Atsuta R, Miyake S, Takahashi K
  • 雑誌名: Biomolecules 巻: 12 ページ: 518
  • DOI: 10.3390/biom12040518.
  • 査読あり
• [学会発表] 培養気道上皮細胞とOVA誘発喘息マウスモデルにおけるMAP3K19の役割 (2022)
  • 著者名/発表者名: 三道ユウキ、原田紀宏、原田園子、笹野仁史、安部寿美子、上田翔子、西牧孝泰、佐藤良彦、渡邉敬康、竹重智仁、松野圭、伊藤潤、秋葉久弥、高橋和久
  • 学会等名: 東京呼吸器リサーチフォーラム
• [学会発表] 末梢血中MAIT細胞、好中球、血清ぺリオスチンのメポリズマブ治療効果予測バイオマーカーとしての可能性 (2022)
  • 著者名/発表者名: 笹野 仁史、原田 紀宏、原田 園子、竹重智仁、三道 ユウキ、田辺 悠記、石森絢、松野圭、長岡鉄太郎、伊藤 潤、千葉麻子、秋葉久弥、熱田了、出原賢治、三宅幸子、高橋和久
  • 学会等名: 第3回日本喘息学会学術大会
• [学会発表] Tim4による炭素微粒子の認識および炎症応答の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 黒岩美希、山口慎一郎、加藤慶宜、秋葉久弥、中山勝文
  • 学会等名: 第29回日本免疫毒性学会学術年会
• [学会発表] スギ花粉症合併喘息患者における舌下免疫療法による症状改善効果と末梢血リンパ球分画の変化 (2022)
  • 著者名/発表者名: 上田翔子、伊藤潤、原田園子、笹野仁史、三道ユウキ、田辺悠記、安部寿美子、渡邉敬康、佐藤良彦、西牧孝泰、牧野文彦、塩田智美、児玉裕三、長岡鉄太郎、千葉麻子、秋葉久弥、三宅幸子、熱田了、原田紀宏、高橋和久
  • 学会等名: 第88回臨床アレルギー研究会
• [学会発表] Soluble TIM-4 levels in serum are associated with severe asthma phenotype. (2022)
  • 著者名/発表者名: Yuki Tanabe, Hisaya Akiba, Norihiro Harada, and Sachiko Miyake.
  • 学会等名: 第51回日本免疫学会総会
• [備考] 順天堂大学医学部免疫学講座
  • URL: https://www.juntendo.ac.jp/graduate/laboratory/labo/meneki/home.html