| 研究課題/領域番号 |
20H03475
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| 研究機関 | 東邦大学 |
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研究代表者 |
中野 裕康 東邦大学, 医学部, 教授 (70276476)
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| 研究分担者 |
寺井 健太 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20616073)
柳川 正隆 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 研究員 (70609792)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ネクロプトーシス / アポトーシス / 1分子イメージング / FRET / MLKL / トランスジェニックマウス / cFLIPL / MIB2 |
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| 研究実績の概要 |
1) MLKL-HaloTag融合タンパク質を発現させた細胞を用いた１分子イメージングにより、刺激前に細胞膜近傍と細胞質とをMLKLがシャトリングしていることを見出した。全反射顕微鏡を用いた解析により細胞膜上でMLKLが集簇している部位から、細胞内容物が放出される現象の可視化に成功した。
2)トランスポゾンベクターを使用することにより蛍光強度の強いSMART Tgの２ラインを樹立することができた。In vivoでのネクロプトーシス細胞をイメージングするために、予備実験として大量のTNFを投与するモデルにおける小腸上皮細胞のネクロプトーシス、シスプラチン投与による尿細管上皮細胞のネクロプトーシスを検討した。リン酸化RIPK3陽性（ネクロプトーシスの指標）の小腸上皮細胞は非常にわずかしか認められなかったものの、尿細管上皮細胞はかなりの細胞がリン酸化RIPK3陽性なことから、今後はシスプラチン投与の系を用いてin vivoのFRET解析を行う予定である。
3) cFLIPLはデス受容体によるアポトーシスやネクロプトーシスの抑制に中心的な役割を果たす分子である。cFLIPLのユビキチン化に関与するユビキチン化リガーゼの網羅的な解析を行いMind bomb 2(MIB2)というリガーゼを同定した。このリガーゼは直接cFLIPLに会合してcFLIPLにK48型およびL63型のユビキチン鎖を付加していた。逆にMIB2欠損細胞ではcFLIPLのユビキチン化が低下していた。MIB2と会合できない変異体cFLIPL(3A)や、MIB2によりユビキチン化されるリシン残基を全てアラニンに置換したcFLIPL変異体(K9R)を発現した細胞では、cFLIPLによるアポトーシス抑制活性が低下することが明らかとなった (Nakabayashi, Communication Biology, 2021)。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1) 1分子イメージングの解析は着実に進んでおり、TNFなどによる刺激前にMLKLが細胞膜と細胞質とをシャトリングしているという新しい知見を得た。
2)新たに２系統のSMART Tgマウスを樹立し、初代培養細胞を用いた解析からネクロプトーシスの誘導に伴いFRET比が上昇することを見出している。またin vivoでのネクロプトーシスをイメージングするために、どのマウスモデルが最適かを既に決定している。
3) 当初予定していたプロジェクト以外に、cFLIPLのユビキチン化に関与するリガーゼとしてMIB2を同定し、cFLIPLのユビキチン化による新たな活性制御機構を明らかにすることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ネクロプトーシスをin vivoでライブセルイメージングするためのSMART Tgマウスはトランスポゾンベクターを使用することにより蛍光強度の強い２ラインを樹立することができた。さらに予備実験の結果からSMART Tgマウス由来の腹腔マクロファージはネクロプトーシスに伴いFRET比が上昇することを確認した。本来は今年度にこのマウスを使用してin vivoでのFRET解析を京都大学で多光子顕微鏡を用いて行う予定だった。しかし新型コロナウイルス感染拡大が持続しているために、人の移動が制限され、京都大学に実験に行くことができず、in vivoでのイメージングができなかった。移動制限および新型コロナ感染の拡大が収束した後にマウスを用いた解析を行う予定である。
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