| 研究課題/領域番号 |
20H03536
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| 研究機関 | 東京医科大学 |
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研究代表者 |
横須賀 忠 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (10359599)
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| 研究分担者 |
若松 英 東京医科大学, 医学部, 講師 (40632617)
町山 裕亮 東京医科大学, 医学部, 講師 (40704606)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | キメラ抗原受容体 / CAR-T細胞 / シグナル伝達分子 / イメージング / マイクロクラスター / 免疫シナプス / 免疫チェックポイント / T細胞補助シグナル |
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| 研究実績の概要 |
キメラ抗原受容体CAR-T細胞療法は、多発性骨髄腫に対する適応が日本においても認可されと同時に、順調に臨床での使用が進んでいる。一方、CAR-T細胞も養子免疫療法としてT細胞へのCAR遺伝子導入を方法の基本とする限り、免疫チェックポイント受容体などによるT細胞疲弊という問題を抱えている。ゆえに、すでに第4のがん治療として確立した免疫チェックポイント阻害療法の革新的な治療成績から、CAR-T細胞療法と抗PD-1/PD-L1抗体投与との併用や、CARと既存または新規のがん治療法との併用療法がさまざなま治験として遂行されている。しかしいずれの治療も非常に高額であり、根本的に疲弊しないCARそのものをリ・エンジニアリングする選択肢も試されるべきたと考えた。一貫した超解像1分子1細胞研究によって、T細胞の活性化はTCRをコアとするシグナルユニット「マイクロクラスター」によって制御されることを明らかにしてきた。また先行研究からはCAR-T細胞においてもマイクロクラスターが活性化の最小ユニットとして機能していることが示唆されている。この結果からTCRマイクロクラスターと同様に、CARもPD-1と同じシグナロソームとして同じマイクロクラスターを形成しているためCARシグナルも抑制されること、よってCARとPD-1のマイクロクラスターを分画することで疲弊を回避可能なCARのニューデザインが見えてきた。本研究では、これら先端的分子イメージングの視点からCAR-T細胞を介したがん抗原の認識と細胞傷害機能、CAR-T細胞疲弊が誘導される分子メカニズムを解明し、免疫チェックポイント受容体による機能抑制を自発的に解除するCARをリ・デザインすることで、より効果的かつ経済的なCAR-T細胞療法を提案することを目的とした。TIGITのリガンド型CAR-T細胞で良好な結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト(h)CD19およびhCD5 CAR-T細胞用のリガンドhCD19およびhCD5を導入した人工平面脂質二重膜を用い、共焦点レーザー顕微鏡および超解像度全反射傾向顕微鏡にて受容体および下流のシグナル伝達分子の挙動を解析した。hCD19/CD5 CAR分子の基本画像データは順調に取得できた。これらのCARを新たに、CD4もしくはCD22の免疫グロブリン(Ig)ドメインを用いて伸長すべくベクター作成した。Igドメイン4つ以上のCARの細胞表面発現は弱かったが、それを含めてPD-1との共局在およびPD-1抑制を調べた。しかし、予想していたPD-1抑制からの回避の機能を持ったCARはなかった。そこで、Igドメインの伸長なしに背の高い分子を用いたリガンド型CARの検討を行った。リガンドとしてはCD155を採用した。CD155は免疫チェックポイント受容体TIGIT、CD96および活性型受容体DNAM1のリガンドであり、モデルとして実験系に応用しやすい理由からである。現在、CD155リガンド型CARの1細胞イメージングと生化学的解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
電子顕微鏡JEM-1400FlashによるCAR-T細胞と標的細胞の細胞接着面の距離測定は、hCD19とhCD5 CARで成功している。CD155リガンド型CAR-T細胞とTIGIT、CD96およびDNAM1を発現した標的細胞とのシナプス面を画像取得し細胞間隙を測定し、エクトドメインを伸長させた複数のCARでは法則性のない反応性低下が見られた。CARがリガンドと結合してもシグナルが生まれるドメインを探索している。
新規デザインしたD155リガンド型CARのシグナル伝達経路の検証は、抗原提示人工平面脂質二重膜上に形成されたCARマイクロクラスターのチロシンリン酸化状態をリン酸化特異的抗体にて検出することと、キナーゼZAP-70やアダプタータンパク質SLP-76やLATのCARマイクロクラスターへのリクルートをイメージングにて確認する。同時に、生化学的解析によってCAR分子に上記のリン酸化されたシグナル伝達分子もしくは分子そのものが会合するかを経時的に確認する。またリガンドがTIGIT、CD96、DNAM1の時、またPD-L1が脂質二重膜上にあるとき、またはPD-1を架橋したときにCARの活性化が減弱するか、もし減弱するようなら高さの違いのあるCAR間で差がないか検討する。
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