| 研究課題/領域番号 |
20H03638
|
|---|
| 研究機関 | 筑波大学 |
|---|
研究代表者 |
水谷 英二 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (80443034)
|
|---|
| 研究分担者 |
水野 直彬 東京大学, 医科学研究所, 特任研究員 (30815642)
山口 智之 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (80392158)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | 染色体移植 / トリソミー / モデル動物 / キメラマウス |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究計画は、哺乳類胚・細胞間での染色体移植技術を開発することで、ヒト染色体保有マウスES細胞およびこれを用いたキメラ個体を作製し、新たなヒトトリソミーモデルマウスを作出することを目的とする。このため、①異種間核移植技術を応用したヒト単一染色体移植技術の開発、②ヒト染色体保有マウスES細胞の樹立及び解析、③ヒト染色体保有マウスES細胞を用いたキメラマウス作製と解析、④目的ヒト染色体の標識法の開発、⑤ゲノム編集技術によるヒト染色体の遺伝子改変、の5項目について実施していく。これらの項目は順次行うのではなく、各ヒト染色体について並行して実施する。
今年度は、昨年度に構築したマウス卵子を介したヒト染色体操作技術を用いて、マウス受精卵へヒト染色体を導入し、ここからヒト染色体保有マウスES細胞株を樹立した。樹立した細胞株は各ヒト染色体特異的に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより、ヒト染色体を保持しているか、保持していた場合何番染色体かを解析した。現在までに一部の常染色体と性染色体を除くヒト染色体を保有する細胞株が得られている。さらに、いくつかの細胞株を用いたキメラ形成実験を行った。ヒト染色体を保有するマウスＥＳ細胞株はホスト胚と協調して分化し、キメラマウス体内の各臓器への寄与が認められた。現在、キメラマウスの各臓器のキメリズム、ヒト染色体保有率などを解析中である。また一部の細胞株に対して、導入されたヒト染色体へ対する蛍光マーカーおよび薬剤耐性遺伝子のノックインを行い、安定的にヒト染色体を保持させることにも成功した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト染色体移植法の開発、ヒト染色体移植マウス胚からのES細胞株樹立、キメラ個体作製、ヒト染色体への遺伝子導入と段階を踏んで計画をすすめられており、概ね順調に進行していると考えている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
下記の5つの項目について継続して行い、ヒト染色体異常症モデルマウス作出を目指す。①前年度に確立したヒト単一染色体移植技術のブラッシュアップ。マウス卵細胞質中でのヒト染色体の効率的なラベル方法、分散方法をさらに検討する。
②ヒト染色体保有マウスES細胞の樹立および解析。ヒト染色体が導入されたマウス胚をin vitroで胚盤胞期まで培養し、ヒト染色体をもつマウスES細胞株作製を試みる。各ヒト染色体各所に設計した特異的プライマーを用いたPCRと核型解析・FISHにより、何番のヒト染色体が導入されているか、また全長が導入されているかを調べる。
③ヒト染色体保有マウスES細胞を用いたキメラマウス作製と解析。樹立したヒト染色体保有マウスES細胞からキメラ個体を作出する。キメラマウスは組織学的手法、デジタルPCRによるゲノムコピー数定量等を用いて各臓器へのドナー細胞寄与率とヒト染色体保持率を測定する。併せて組織よりRNAを抽出し、次世代シークエンスによるトランスクリプトーム解析やqPCRにより、ヒト染色体からの転写とその影響を評価する。さらにHE染色・免疫染色により病理学的解析を実施し、染色体トリソミーによる発生および臓器形成への影響を調べる。
④目的ヒト染色体の標識法の開発。ゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを応用して、マウス胚に導入されたヒト染色体の可視化を試み、目的染色体を狙って操作できか検討する。
⑤ゲノム編集技術による導入ヒト染色体の遺伝子改変。CRISPR/Cas9等のゲノム編集技術を用いて、ヒト各染色体上のセーフハーバー領域に薬剤耐性遺伝子のノックインを行い細胞の安定維持、選別を可能にする。これらの一連の操作により、ヒト染色体保有細胞の例数を増やす。
|
