| 研究課題/領域番号 |
20H03642
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
斎藤 潤 京都大学, iPS細胞研究所, 准教授 (90535486)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 神経筋接合部 / 多能性幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
神経筋接合部(Neuromuscular junction: NMJ) は運動神経と筋組織の接合部であり、シナプスが形成されている。NMJの機能異常は様々な疾患を引き起こすが、なかでも先天性筋無力症候群(congenital myasthenic syndrome: CMS)をはじめとする先天性疾患は特異的治療法が存在しないものも多く、その病態解明と治療法開発は重要である。申請者らは、2019年度までの科研費基盤Bにおいて、ヒト多能性幹細胞から運動神経や骨格筋などを同時に誘導し、機能的・形態的に成熟したNMJを構築する系を発明した(Lin CY, JCI insight 2019)。本申請では、この分化系を活用し、CMSや脊髄性筋萎縮症を対象疾患として、ヒトNMJ病変の病態解明を目標とする。
本年度は、①脊髄性筋萎縮症患者さんのiPS細胞を用いた骨格筋病変モデルの解析を行った。結果、MYOD1依存性のマイクロRNAの発現にSMNが関与していることを明らかにした。また、②前年度までに樹立したアセチルコリン受容体εサブユニットをノックアウトしたiPS細胞を用い、神経筋接合部の分化誘導を行った。結果、ノックアウト細胞では顕著に神経筋接合部の形成が阻害されていた。また、神経細胞を光遺伝学的手法で興奮させ、筋収縮を見たところ、ノックアウト細胞で筋収縮が阻害されていた。以上のように、先天性筋無力症のモデリングに成功した。
以上より、本年度の計画は予定通り進んでおり、次年度も神経筋接合部病態の詳細な解析を進めていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
実績欄に示した通り、当初の本年度目標であった疾患モデルの解析が進捗している。
このため、進捗は予定の100%と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
予定通り研究が進捗しているので、引き続き当初の計画に沿って研究を進める。
先天性筋無力症候群について：NMJの分化効率の低下をきたすメカニズムの解析を進める。前年度同様、免疫染色(Synaptic vesicle 2+αBTX)やNMJの機能評価を実施する。
脊髄性筋萎縮症について： MYOD1のChIP-seqや骨格筋細胞のRNA-seqを行うなどして、マイクロRNAの制御メカニズムをさらに詳細に検討する。
NMJの機能評価について：以下の項目を引き続いて実施する。I.NMJ依存性の筋収縮能：ソニー(株)と共同開発した筋収縮能の測定機器（研究室内に設置）を用いて、疾患iPS細胞と対照との間の筋収縮能（筋収縮の加速度・筋収縮の頻度）を観測する。成熟NMJの筋収縮能評価には光遺伝学的手法を用いる。神経細胞にシナプシンプロモーター下に光作動性チャネルを発現するベクターを導入し、光刺激により神経細胞を興奮させ、筋収縮を評価する。II.電子顕微鏡による微細構造観察：シナプス前・後の詳細な構造を電子顕微鏡で観察し、疾患群での差異を見出す。III.細胞内カルシウム濃度の変動：カルシウム指示薬を筋細胞に導入し、筋収縮能の評価と同様の刺激を用いて細胞内カルシウムない濃度の変動を観察する。これは筋収縮能との同時観察が可能であり、骨格筋の興奮と収縮のカップリングが適切に行われているかを評価することが出来る。
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