| 研究課題/領域番号 |
20H03708
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
正本 庸介 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (30706974)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 急性骨髄性白血病 |
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| 研究実績の概要 |
MLL-AF9、MLL-ENL融合遺伝子をレトロウィルスを用いてEVI1-GFPノックインマウスのHSCに導入して作製したAMLマウスモデルからAML細胞を回収し、未分化な分画のGFP陽性(HSC様AML細胞)、GFP陰性(GMP様AML細胞)の比較を行った。半固形培地を用いたコロニー形成実験では、マウス個体差が大きいものの、概してGMP様AML細胞の方が高いコロニー形成能が見られた。同系マウス移植実験においてGMP様AML細胞の方が高い生着率を示す、すなわち幹細胞活性が高いと考えられることと一致する結果であった。AMLマウス個体に対してin vivoでAMLの治療に使われる化学療法剤を投与すると、GFP陽性細胞が残存し、HSC様AML細胞の化学療法抵抗性が示唆されたにもかかわらず、in vitroではこれらの薬剤を添加して培養しても生存率および増殖に差は見られなかった。これらのことから、HSC様AML細胞はin vivoにおいてのみ化学療法抵抗性に関与し、難治性AMLの発症に関わるものの、幹細胞としての活性は低下しており、その性質の維持には骨髄微小環境からのシグナルを必要としていることが示唆された。
また同系マウス移植実験を行うとGMP様AML細胞のみから成る個体からはGMP様AML細胞のみが再構築されたが、両者を有する個体からは、HSC様AML細胞の移植、GMP様AML細胞の移植のいずれにおいても、両者の細胞が再構築された。これらの細胞は状況に応じて表現型が変化する可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
HSC様AML細胞、GMP様AML細胞について、GFPの発現パターンの個体差が大きいことに起因する細胞数を確保するための技術的な問題か、遺伝子発現パターンの個体差が大きく、遺伝子発現プロフィールの解釈が難しかった。これらの細胞の表現型やin vitroおよびin vivoでの性質を記述するために解析を行う中で、上述のように、これらの細胞がin vivoにおいては環境に応じて双方向性に変化しうることや、HSC様AML細胞はin vitroで培養すると正常HSCと同様、容易にその性質を失うことが明らかになった。細胞数が少なくても安定した発現解析が可能のため、今後は解析個体数を増やし、GFP発現に関してよりfineな分画を用いて遺伝子発現プロフィールを比較することで、各個体に共通する発現変動遺伝子群を同定する。
またマウスのAML細胞をCRISPRスクリーニングに用いるためにレンチウィルスおよび薬剤選択によりCas9およびdCas9の導入を試みている。ヒトAML細胞などでは導入が確認できるものの、マウスAML細胞においては薬剤選択後mRNAレベルでは発現が確認できるものの、タンパクレベルでのCas9/dCas9発現が確認できていない。細胞種特異的な問題の可能性もあり、現在GFP切断により機能的なCas9発現の確認を試みており、同方法により発現が確認できた場合は計画通りに実験を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
MLL-AF9、MLL-ENL融合遺伝子をEVI1-GFPノックインマウスのHSCに導入して作製したAML細胞のうち、未分化な分画のGFP陽性(HSC様AML細胞)、GFP陰性(GMP様AML細胞)を回収し、RNA-seqにより遺伝子発現パターンを比較し、HSC様AML細胞に特異的なシグナル伝達経路を明らかにする。またGFP陽性AML細胞に含まれるHSC様AML細胞に特有の遺伝子発現パターンや、関与する分子、シグナル経路を明らかとするとともに、HSC様AML細胞を濃縮するための表面抗原を明らかにする。
HSC様AML細胞の発生・維持に必要な因子を明らかにするために、GMP様AML細胞にレンチウィルスを用いてdCas9を導入した後にCRISPR活性化ライブラリーを導入し、GFP陽性および化学療法抵抗性でスクリーニングした細胞に対して次世代シーケンサーを用いて、HSC様AML細胞への変化および化学療法抵抗性を獲得するような遺伝子を検索する。
さらにAssay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC)-seq, 種々の抗ヒストン抗体を用いたクロマチン免疫沈降(ChIP)-seqを用いて、HSC様AML細胞のエピジェネティックな特徴を明らかにする。AMLにおいては病型ごとにスーパーエンハンサーの出現パターンが極めて特徴的な挙動を示し、エンハンサーの異常が病態に密接に関連していることが報告されているため、特にHSC様AML細胞のスーパーエンハンサーのプロファイルに注目して解析する。
これらの結果を統合することで、HSC様AML細胞に特異的な治療標的の候補を見出す。
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