| 研究課題/領域番号 |
20H03757
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
藤井 正幸 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (00867575)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 大腸がん / オルガノイド / 遺伝子変異 / 発がん / 転移 / 遺伝子スクリーニング |
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| 研究実績の概要 |
本邦および世界における大腸がん罹患患者数は増加の一途をたどっている．国際コンソーシアムによるシーケンス解析に代表される大規模解析を通じ，大腸がんにはいかなる遺伝子異常が生じているか明らかになりつつある．しかしながら，浸潤や転移といったがんに根源的な形質を説明する分子異常の理解はまだ不十分である．従来，大腸がんモデルとして癌細胞株や遺伝子改変マウスが頻用されてきたが，癌細胞株は臨床腫瘍の形質を完全に体現しているとは言い難く，マウスには種差や低スループット性等の難点がある．本研究ではオルガノイド技術を活用し臨床腫瘍組織から患者由来オルガノイドを樹立し,多角的な分子生物学的解析や遺伝子編集技術を駆使することで，ヒト大腸がんの表現型を規定する分子メカニズムに迫る．当該年度はその基盤となる複数の大腸癌オルガノイドの樹立し，エキソーム解析，トランスクリプトーム解析を通じて分子異常を把握した．さらに，転移や薬剤耐性をはじめとしたがんの表現型に寄与する遺伝子群をバイアスなく選出するため，患者由来オルガノイドを対象としたCRISPRノックアウトスクリーニングを立ち上げた．当該年度はスクリーニング系の妥当性，正確性の検証のため小さななライブラリスケールでのスクリーニングを実施し，オルガノイドの培養条件から予想される遺伝子が有意に濃縮されることを実証した．これらの成果により，臨床の腫瘍組織を模したオルガノイドを用いた遺伝子ノックアウトスクリーニングが可能となり，異種移植等の技術との統合によって大腸がんの悪性度に関わる浸潤や転移の分子レベルでの理解につながることが期待される．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1．患者由来大腸がんオルガノイドの統合的解析
当研究室が有する患者由来大腸腫瘍オルガノイドライブラリ（Fujii et al., Cell Stem Cell 2016）を拡充する形で，主に遠隔転移を伴う大腸がん症例よりオルガノイドを複数樹立した．樹立したオルガノイドの分子異常を把握するため，エキソーム解析による遺伝子変異解析，マイクロアレイあるいはRNAシーケンスによるトランスクリプトーム解析を行った．また，エピゲノム解析のため一部のオルガノイドを対象として，アセチル化ヒストン（H3K27Ac）のChIPシーケンス，ATACシーケンス，メチル化DNAマイクロアレイ解析を行った．これらの解析を通じ，本大腸癌オルガノイドライブラリは大腸がんの分子生物学的分類として提唱されている染色体不安定がん，ゲノム安定がん，マイクロサテライト不安定がんの全てを網羅していることを確認した．
2．患者由来大腸オルガノイドを対象としたノックアウトスクリーニング
大腸オルガノイドを用いた遺伝子ノックアウトスクリーニングを立ち上げるため，100遺伝子程度の小スケールライブラリによる検証を行った．CRISPRのガイドRNAは1遺伝子あたり4つ設計し，Humanized Cas9を強制発現させた大腸オルガノイドにレンチウイルスCRISPRライブラリを感染させた．ポジティブセレクションとしてオルガノイド培地に幾つかの阻害剤を添加し，そのターゲット遺伝子が選出されるかを検証したところ，期待されるガイドRNAが統計学的に有意に濃縮されることを確認した．再現実験でも同様の結果が得られ，スクリーニングの妥当性，正確性が実証された．
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| 今後の研究の推進方策 |
網羅的ノックアウトスクリーニングを用いた大腸がん新規ドライバー遺伝子の探索
前年度の実績により，大腸腫瘍オルガノイドおよびCRISPRライブラリを用いた遺伝子ノックアウトスクリーニングが可能となった．今後は大腸腫瘍オルガノイド異種移植モデルにこのシステムを応用し，肝転移や浸潤，薬剤耐性等の大腸がんの表現型に寄与する遺伝子を探索する．当研究室の以前の研究により，大腸癌における代表的な遺伝子変異のみではこれらの形質は獲得されないことが判明しており（Matano et al., Nature Medicine 2015），本研究ではこの研究で樹立した人工大腸癌オルガノイドに大してポジティブセレクションスクリーニングを実施する．転移，浸潤をin vitroで正確に評価するのは困難であるため，ライブラリを感染させたオルガノイドを異種移植に用いることでスクリーニングを実施する．転移巣や浸潤部を大量に回収することは困難であるため，効率的なスクリーニングのため既知の浸潤，転移遺伝子，およびオルガノイドの分子解析から導出された遺伝子をピックアップし，ライブラリに用いることとする．薬剤耐性については，臨床で用いられている薬剤を中心に検討する．薬剤試験はin vitroで高スループットで実施可能なため，ゲノムワイドなライブラリでスクリーニングを行う予定である．
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