| 研究課題/領域番号 |
20H03770
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
毛受 暁史 京都大学, 医学研究科, 准教授 (30527081)
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| 研究分担者 |
佐藤 篤靖 京都大学, 医学研究科, 講師 (30706677)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | p53変異 / 上皮間葉転換（EMT) / RNA-seq / 浸潤転移能 / Transgenic mouse |
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| 研究実績の概要 |
我々は、肺癌において、最も高頻度に観察されるp53遺伝子変異に伴う上皮間葉転換（EMT）亢進による癌悪性化の研究およびその治療戦略の開発を目的とした研究を行っている。
2021年度は、p53変異によるEMT活性化の相違を解析することで、EMTがどのよう経路が活性化しているかについて明らかに使用としている。今回、機能亢進型や機能抑制型など様々なタイプの変異型p53ベクターの作成を行い、現在まで合計10種類のHotspot変異型p53ベクターを作成した。それらのベクターによる肺癌細胞株への遺伝子導入を行い、５種類のHospot変異でEMT活性が亢進していることが確認された。このうち、最もEMT活性化がみられる２種類やEMT活性みられない変異、negative controlの４種類のtransformed cellsをRNA-seq/miRNA-seqを行っている。これらの解析により、EMTと強い関連のある経路について解析をすすめる予定である。またEMTの際に活性化するシグナル経路であるArf6-AMAP1経路とPD-L1発現について解析を進めた。結果、AMAP1発現低下により、negative feedbackと考えられるEGFR経路の活性化が起こり、その結果として、PD-L1発現が上昇することを見出した。
次にluciferaseを利用したpromoter reporter assayによるhigh through-put screeningの系を立ち上げることができたため、p53変異導入誘導性などのEMTを起こす様々な細胞株にassay用vectorをtransfectionして、安定発現株の作成を行った。
またEGFR変異transgenic mouseとp53変異transgenic mouseを入手し、それぞれの遺伝子型を確認して、交配をすすめている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、コロナウイルス感染などによる研究者の離脱や遅滞があり、進捗がやや遅れた。
p53変異による肺癌のEMT活性化について、様々なタイプの変異による相違を確認した。全１０種類のうち、５種類については、E-cadherinの低下およびVimentinの亢進やZEB1亢進を認め、EMT活性化が確認できた。これらの細胞株のRNA-seq/miRNA-seqによる網羅的解析を行い、シグナル解析やontology解析中である。またEMT活性化のphenotypeとして、浸潤転移能、薬剤耐性などの観点から解析する予定である。
A549肺癌細胞株のTGFβ添加によるEMTを阻害する物質のdrug screeningを前述のHTSの系を用いて行い、約2400種類の既存薬剤、compoundから７種類の薬剤でE-cadherinの発現亢進、vimentinの発現抑制を確認した。この系に使用したvectorを用いて、p53誘導性EMT活性化がみられた肺癌細胞株に対するtranfectionを行い、E-cadherin
やVimentin発現に比例したluciferaseを発現する細胞株を作成した。これらの安定発現細胞株を用いて、drug screeningを行い、有効な薬剤を検索することが可能となる。
また肺腺癌を発生するEGFR変異マウスを入手した。このマウスにp53変異conditional transgenicマウスを交配させるため、各マウスの遺伝子型を確認した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度については、様々なp53変異導入肺癌細胞株について、RNAseq/miRNA-seqの解析による網羅的解析を行い、その特徴や活性化経路を明らかにする。そして、これらの経路が実際に活性化しており、阻害する事により、EMTが回復することを確認する。
またこれらの細胞株についてin vivoにおける浸潤転移能や薬剤耐性化能についても、解析を行う。
p53遺伝子変異導入によるEMTにおいても、その回復を促進する薬剤screeningを行う。様々なDrug screening compound setを使用して、薬剤selectionを行い、ヒトへの応用可能性を探索する予定である。
またEGFR変異mouseとp53変異mouse modelを掛け合わせて、p53変異を有するEGFR変異肺癌発生mouse modelを作成する。p53変異マウスはconditional mouseのため、まずは同マウスのhomo接合マウスを作成し、さらにhetero接合であるEGFR変異マウスを交配する。発生した肺癌を野生型p53のEGFR肺癌と比較し、その組織型やvivo内での変化を解析する。
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