| 研究課題/領域番号 |
20H03859
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
米田 俊之 大阪大学, 歯学研究科, 招へい教員 (80142313)
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| 研究分担者 |
奥井 達雄 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (40610928)
波多 賢二 大阪大学, 歯学研究科, 准教授 (80444496)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 乳酸シャトル / 骨転移 |
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| 研究実績の概要 |
2020年度は乳がん細胞の腫瘍形成における乳酸受容体GPR81の役割を明らかにした。そこで、2021年度はGPR81を介した乳酸シャトルが、どのような分子メカニズムで乳がん細胞の悪性度に関与しているかについて検討を行った。
乳酸シャトルの阻害によるがん細胞の細胞特性変化を分子レベルで解明するために、GPR81遺伝子ノックダウン(shGPR81)およびコントロールとして既知遺伝子配列と類似しない配列デザイン(shNT)を組み込んだ乳がん細胞を作製した。各々の細胞からRNAを回収し、RNA-seqにより遺伝子発現の変化を検討しGene Ontology解析を行った結果、shNT細胞に比較してshGPR81で減少している遺伝子は細胞運動に関与する遺伝子群が有意にenrichされていることが明らかとなった。そこで、Wound Healing AssayによりshGPR81細胞およびshNT細胞の細胞運動能について検討を行った結果、shGPR81細胞では細胞遊走能が著明に低下していた。さらに、2層構造トランスウェルチャンバーを用いたマトリゲル浸潤アッセイによりshGPR81細胞では細胞外基質浸潤能も有意に低下していることを見出した。
がん細胞の増殖には解糖系の亢進によるエネルギー供給源ATPの産生が必須である。そこで、shGPR81細胞における解糖系代謝ならびにATP産生を検討した。shGPR81細胞では不可逆性の反応を司る律速酵素HK2、PFK1および乳酸脱水素酵素LDHAのmRNA発現が低下していた。また、解糖系酵素の発現低下に一致してshGPR81細胞では細胞内ATP濃度の低下が見られた。以上の結果より、GPR81は解糖系によるATP産生を調節することでがん細胞の増殖を制御することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021年度は乳酸がGPR81を介してがん細胞の代謝リプログラミングや転移能を制御していることを明らかにすることができた。これらの研究成果は、がん細胞におけるGPR81の新しい機能を見出したと考えられるため、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和４年度は、骨内でのがんの増大、骨破壊、骨から肺への二次転移、ならびに骨痛に対する乳酸シャトルならびに乳酸受容体GPR81の役割を検討する。乳がん細胞の脛骨注入モデルを用いて骨転移を誘導し、がん微小環境を構成する間質細胞、破骨細胞ならびに神経細胞におけるMCT1,MCT4およびGPR81の発現について検討することで、骨転移における発現の変化を病理学的に検討する。そして乳酸を取り込むMCT1 (AZD3965)、乳酸を放出するMCT4 (CHC)、ならびにMCT1/MCT4の両者(syrosingopine)の阻害剤を用いて乳酸シャトル阻害の影響をin vitroとex vivoで検討する。また、乳酸受容体GPR81の阻害剤は入手不可であるため、cAMPを指標にしたハイスループットスクリーニングシステム(HTS)を構築し、乳酸によるGPR81の活性化を阻害する化合物の探索を行う。HTSでスクリーニングされた化合物をIn Vitroでがん細胞の増殖能を指標にして絞り込んだ後、皮下接種ならびに脛骨注入モデルを用いて生体内での腫瘍形成に対する効果を検討する。乳酸シャトルおよびGPR81阻害によるがん細胞の細胞特性変化を分子レベルで解明するために、各々の阻害剤で処理した細胞からRNAを回収し、RNA-seqにより遺伝子発現の変化を検討する。さらに、変動のあった遺伝子群のGO解析を行うことで、乳酸シャトルおよびGPR81の阻害によりがん細胞の代謝がどのように変化するかを検討する予定である。
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