| 研究課題/領域番号 |
20H03859
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
米田 俊之 大阪大学, 大学院歯学研究科, 招へい教員 (80142313)
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| 研究分担者 |
奥井 達雄 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (40610928)
波多 賢二 大阪大学, 大学院歯学研究科, 准教授 (80444496)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 乳酸シャトル / 骨転移 |
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| 研究実績の概要 |
2022年度は細胞外へ乳酸を放出することで乳酸シャトルの形成に貢献するモノカルボン酸トランスポーター4（MCT4）の役割と、乳酸感受性受容体であるGタンパク質共役受容体81（GPR81）の関与を中心に解析を行った。
マウス（EO771）およびヒト（MDA-MB-231）乳がん細胞を脛骨の骨髄腔に注入した骨転移モデルマウスを用いて、骨転移ならびに腫瘍形成に伴う癌性骨痛の分子メカニズムを検討した。骨髄内に乳がん細胞を接種すると骨破壊を伴う腫瘍を形成した。また、乳がんを接種されたマウスは癌性骨痛を示すことをダイナミックプランター・エステシオメータにより確認した。乳がん細胞を接種した側の感覚神経の後根神経節（DRG）では、ニューロン興奮の分子指標であるリン酸化pERK1/2とcAMP-response element-binding protein（pCREB）の細胞内シグナルが活性化していることがウェスタンブロット法により明らかとなった。さらに、MCT4遺伝子をノックダウンした乳がん細胞を接種すると、親株の乳がん細胞を接種し時に比較してDRGにおけるpERK1/2とpCREBの発現が低下するとともに癌性骨痛も減弱していた。さらに、感覚神経細胞においてGPR81遺伝子をノックダウンすると、乳酸刺激によるpERK1/2の上昇とCa2+流入が抑制され感覚神経細胞の興奮が阻害されることが明らかとなった。以上の結果より、乳がん細胞からMCT4を介して細胞外に放出された乳酸は、ニューロンのGPR81を活性化させることで癌性骨痛に寄与していることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2022年度は乳酸を細胞外に放出することで乳酸シャトルを制御するMCT4の役割を明らかにすることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度は骨内でのがんの増大ならびに骨痛に対するMCT4ならびにGPR81の役割を明らかにした。2023年度はこれまでの研究を発展させ、乳酸シャトルを阻害することで抗腫瘍作用を発揮する治療法の確立を目指す。具体的な研究実施計画を下記に示す
１）バイオセンサーによるcAMP評価系の構築：細胞内cAMPを高感度で検出可能なバイオセンサーGloSensorcAMPを、GPR81遺伝子を安定発現させたCHO-K1細胞またはMDA-MB-231乳がん細胞に遺伝子導入し、GPR81阻害剤のスクリーニングに適した細胞株クローンの選別、ならびにハイスループット(HTS)実験系（細胞数、乳酸濃度、反応時間）の構築を行う。
２）ヒット化合物の探索：(1)で確立した乳がん細胞株を384 wellプレートで培養し、乳酸存在下で低分子化合物ライブラリーを作用させる。1次アッセイ(n=1)でGPR81のcAMP阻害作用を回復させた化合物を選別し、再現性試験(n=2)→濃度依存性試験(n=4)を行いIC50≦1μMの化合物をヒット化合物とする。
３）ヒットバリデーション：細胞増殖アッセイならびに担癌モデルマウスを用いて、ヒット化合物の抗腫瘍作用および骨転移への作用をIn VitroおよびIn Vivoで検討する。GPR81阻害によるがん細胞の細胞特性変化を分子レベルで解明するために、スクリーニングした阻害剤で処理した細胞からRNAを回収し、RNA-seqにより遺伝子発現の変化を検討する。さらに、変動のあった遺伝子群のGO解析を行うことで、乳酸シャトルおよびGPR81の阻害によりがん細胞の代謝がどのように変化するかを検討する予定である。
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