2020 年度実績報告書

大動脈瘤病態形成の分子機序解明―突然死の予知・予防を目指して

研究課題

研究課題/領域番号	20H03957
研究機関	和歌山県立医科大学
研究代表者	石田裕子和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (10364077)
研究分担者	野坂みずほ和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (00244731)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2024-03-31
キーワード	大動脈瘤
研究実績の概要	塩化カルシウム誘発腹部大動脈瘤モデルの作製：野生型マウスを用いて腹部大動脈を0.5M塩化カルシウム溶液で15分浸し，沈着したカルシウムによって炎症が遷延化することで大動脈瘤を生じさせた．アンギオテンシンII誘発腹部大動脈瘤モデルの作製：野生型マウスを用いてアンギオテンシンIIを4週間持続全身投与し，動脈硬化を基盤とする大動脈瘤を発生させた．病変部を採取して，ヘマトキシリン-エオジン染色およびマッソン・トリクローム染色を施し，形態学的変化を観察した．また，好中球，マクロファージ，Tリンパ球に対する抗体を用いて，免疫染色を行った．さらに，サイトカイン（IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-g）やケモカイン（CCL2, CCL3, CCL5, CX3CL1, XCL1）について，リアルタイムRT-PCR法により，遺伝子発現を検討した．
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 2つの大動脈瘤モデルを確立し，病変部を採取した．従って，本研究は概ね順調に進展している．
今後の研究の推進方策	１）死亡率の検討：野生型と各種遺伝子欠損マウスの死亡率を比較，検討する．２）RNAシークエンス解析：RNAseq解析により，転写産物の発現を定量化する．採取した試料からtotal RNAを抽出して，次世代シーケンサーを用いたWhole transcriptome解析を行う．膨大なデータから遺伝子発現を推定することができる．また新規遺伝子候補を抽出することも試みる．３）病理組織学的及び免疫組織化学的検討：病変部を採取して，ヘマトキシリン-エオジン染色，マッソン・トリクローム染色，及びエラスチカワンギーソン染色を施し，形態学的変化を観察する．また，好中球，マクロファージ，樹状細胞，Tリンパ球，及びuPA, von Willebrand factorそれぞれに対する抗体を用いて，免疫染色を行う．さらに，サイトカインやケモカインに対する抗体を用いて免疫染色を施し，各物質の局在を免疫組織化学的に検討する．各種免疫担当細胞，及びサイトカイン，ケモカインの免疫組織化学的発現程度を野生型と遺伝子欠損マウスとで比較，検討する．４）サイトカイン，ケモカインの定量：採取した各種臓器をモホゲナイズして，その上清を回収する．上清中のサイトカインやケモカインの濃度を免疫化学的にELISA法で測定する．各サイトカイン，ケモカインの組織内濃度を野生型と遺伝子欠損マウスとで比較，検討する．５）細胞分画の検討：採取した試料を用いて磁気細胞分離装置により各細胞分画に分離した後，フローサイトメトリーにより各細胞分画の比率を解析する．さらに，各細胞分画をソートしてサイトカインやケモカインとの多重染色により，各物質の産生細胞を同定，定量する．