| 研究課題/領域番号 |
20H04334
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
松本 義久 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 准教授 (20302672)
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| 研究分担者 |
横谷 明徳 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 統括グループリーダー (10354987)
島田 幹男 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (20548557)
泉 雄大 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 主任研究員 (20595772)
松尾 光一 広島大学, 放射光科学研究センター, 准教授 (40403620)
林 宣宏 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (80267955)
石合 正道 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 施設長 (90298844)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK) / 放射線 / DNA修復 / タンパク質リン酸化 / タンパク質間相互作用 / タンパク質構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、DNA二重鎖切断(DSB)のセンサーであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK) が何をしているのか、何のために存在するのかを明らかにすることを目的としている。
(1)XRCC4のリン酸化の意義の解明を進めるため、今年度新たにヒト細胞からゲノム編集技術を用いてXRCC4欠損細胞を樹立した。これにXRCC4のリン酸化部位欠損変異体を導入することで、DSB修復に関する種々の機能解析を試みた。機能解析手法の一つとして、in vitroで種々の制限酵素で切断したGFP発現ベクターを細胞に導入し、蛍光を指標としてDSB結合能を測定する新たな系を確立した。その結果、変異によってDSB結合能が減少するものと増加するものが見出され、DSB結合を促進するリン酸化部位と抑制するリン酸化部位が明らかになった。(2)XRCC4の二量体及び多量体のそれぞれについてCD（円二色性）スペクトル測定を実施した。その結果、二次構造のうちβストランドの量が多量体化に大きく関与すること、またC末端側にあるリン酸化サイトをアスパラギン酸置換してリン酸化を擬似するとβストランドの量が増加することを突き止めた。(3)XRCC4の結合分子として、DNA末端のリン酸基の付加・除去を行うPNKPおよびアデニル基の除去を行うAPTXの種々の変異体を作製し、放射線、薬剤感受性、γ-H2AX、53BP1フォーカスなどを指標とした機能解析を行った。また、レーザー照射部位への集積を指標としてDNA損傷部位への動員を解析し、変異の影響やDNA-PKおよびXRCC4依存性の有無を明らかにした。(4)がんリスクとの相関が報告されているXRCC4バリアントについて、放射線感受性、γ-H2AXフォーカスなどを指標とした機能解析を行い、DSB修復機能が低下していることを明らかにした。また、レーザー照射部位への集積を指標として、DNA損傷部位への動員の低下も明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、DNA二重鎖切断の認識と修復及び細胞応答統御におけるDNA-PKの機能と存在意義を明らかにすることを目的とし、NHEJによるDSB修復に関わるXRCC4タンパク質のリン酸化の意義の解明と、新規基質の探索およびリン酸化の意義の解明を二つのサブテーマで進めている。
一つ目のサブテーマに関しては、直ちに結合できないDSBに遭遇した場合に、損傷の形状に応じて他の修復酵素(ヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ・ホスファターゼ、DNAポリメラーゼなど)を動員するために、DNA-PKcsによるXRCC4のリン酸化が重要な役割を果たすであろうという作業仮説に基づいて研究を進めている。初年度より進めてきたCDスペクトル、SAXSによる構造解析からは、XRCC4のリン酸化によってβストランド形成を介して、多量体化が制御されることが示唆された。また、細胞内局所レーザー照射によるDNA損傷部位への動員解析では、DNA末端形状の整形に関わると考えられるPNKP、APTXの損傷部位への動員機構の一端を明らかにすることができた。さらに、今年度は上記の通り、in vitroで種々の制限酵素で切断したGFP発現ベクターを細胞に導入し、蛍光を指標としてDSB結合能を測定する新たな系を確立した。この系では、制限酵素を使い分けることによってさまざまな形状の末端を作ることが可能であり、上記の作業仮説に基づく検討を進める上で有効である。
二つ目のサブテーマであるDNA-PKの新規基質の探索に関しては、二次元電気泳動とAIによる画像解析を用いた新たなプロテオミクス技術を導入し、条件検討の結果、2000個以上のスポットを同定可能な条件を確立した。今後、放射線照射の有無、正常細胞とDNA-PK欠損細胞との比較によってDNA損傷に応答したDNA-PKの新規基質同定につながることが期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
一つ目のサブテーマでは、直ちに結合できないDSBに遭遇した場合に、損傷の形状に応じて他の修復酵素を動員するために、DNA-PKcsによるXRCC4のリン酸化が重要な役割を果たすであろうという作業仮説に基づいて研究を進めている。これまで２年間はXRCC4結合分子としてPNKP、APTXに注目して進めてきたが、現在、プロテオミクス手法により新規結合分子の探索に取り組んでいる。DNA修復機能の解析法として、上記の通り、制限酵素切断プラスミドベクターを基質として用いる新たな実験系を確立した。しかしながら、この系ではXRCC4欠損細胞でも半分程度の結合能が見られる。この部分はNHEJ以外の修復機構（例えば、Alternative end joining、A-EJなど）を反映していると考えられることから、A-EJの抑制などにより可能な限り低減することが望まれる。
二つ目のサブテーマでは、二次元電気泳動とAIによる画像解析を用いた新たなプロテオミクス技術により、新規基質、リン酸化部位の体系的・網羅的探索が可能となった。これにより、DSB修復反応に直接関わる分子群のみならず、修復の足場となるクロマチンの構造制御や転写・複製などとの協調におけるDNA-PKの機能を明らかにし、さらには、核外や種々のオルガネラでの現象も含めて、DSBに対する未知の応答やDNA-PKの役割を見出したいと考えている。
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