ＤＮＡ二重鎖切断の認識と修復及び細胞応答統御におけるＤＮＡーＰＫの機能と存在意義

2022 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20H04334
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 松本 義久 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (20302672)
• 研究分担者: 横谷 明徳 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 専門業務員 (10354987) ; 島田 幹男 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (20548557) ; 泉 雄大 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 主任研究員 (20595772) ; 松尾 光一 広島大学, 放射光科学研究センター, 准教授 (40403620) ; 林 宣宏 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (80267955) ; 石合 正道 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 施設長 (90298844)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK) / 放射線 / DNA修復 / タンパク質リン酸化 / タンパク質間相互作用 / タンパク質構造解析

研究実績の概要

本研究は、DNA二重鎖切断(DSB)のセンサーであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK) が何をしているのか、何のために存在するのかを明らかにすることを目的としている。(1)DNA-PKによるXRCC4のリン酸化の意義の解明を進めるため、リン酸化部位を含む領域を欠失する変異体を作製した。GFPプルダウンと質量分析により、全長XRCC4及びこの欠失変異体に結合する分子を同定した。DNA-PKcs、Ku86、Ku70、LIG4など、XRCC4とともに非相同末端結合(NHEJ)に関わるタンパク質群は全長と欠失変異体の両者でほぼ等量検出された。一方、全長に比べて欠失変異体で著しく少ないタンパク質が数種類見つかった。その結果から、DNA-PKによるXRCC4のリン酸化がDNA損傷応答経路のクロストークに関わる可能性が示唆された。(2)正常XRCC4及びリン酸化部位変異体の二量体及び多量体について 円二色性スペクトル測定及びX線小角散乱測定を行った。その結果、リン酸化はβストランド量を増加させ、フィラメント状の会合体形成の調整に関わることが示唆された。(3)XRCC4の結合分子の一つであるAPTXの解析を行った。ゲノム編集によってAPTXの欠損細胞を作製し、放射線・薬剤感受性、DSB修復能などを解析した。また、GFP-APTX発現細胞で、レーザー照射部位への集積を指標としてDNA損傷部位への動員を解析した。さらに、GFPレポーター基質とI-SceIを用いたNHEJ機能解析を行った。その結果を総合して、APTXがXRCC4とは異なる機構でDNA二重鎖切断修復に関与することを明らかにした。(4)二次元電気泳動とAI解析を組み合わせた新たなプロテオミクス的手法により、放射線照射に応答して現れるスポットを数十個見出した。DNA-PKの新規基質探索の新しいアプローチとして期待される。

現在までの達成度 (段落)

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] SPC Government College(インド)
  • 国名: インド
  • 外国機関名: SPC Government College
• [国際共同研究] Mahidol University(タイ)
  • 国名: タイ
  • 外国機関名: Mahidol University
• [雑誌論文] Structural study of wild-type and phospho-mimic XRCC4 dimer and multimer proteins using circular dichroism spectroscopy (2023)
  • 著者名/発表者名: Nishikubo K, Hasegawa M, Izumi Y, Fujii K, Matsuo K, Matsumoto Y, *Yokoya A.
  • 雑誌名: International Journal of Radiation Biology 巻: Accepted for publication ページ: 未定
  • 査読あり
• [雑誌論文] APTX acts in DNA double-strand break repair in a manner distinct from XRCC4 (2023)
  • 著者名/発表者名: Imamura R, Saito M, Shimada M, Kobayashi J, Ishiai M, Matsumoto Y.
  • 雑誌名: Journal of Radiation Research 巻: Published online ページ: 未定
  • DOI: 10.1093/jrr/rrad007
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Implication of E3 ligase RAD18 in UV-induced mutagenesis in human induced pluripotent stem cells and neuronal progenitor cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Shimada M, Tokumiya T, Miyake T, Tsukada K, Kanzaki N, Yanagihara H, Kobayashi J, Matsumoto Y.
  • 雑誌名: Journal of Radiation Research 巻: 64 ページ: 345-351
  • DOI: 10.1093/jrr/rrac099
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] The Functional Analysis of Genetic Disease Factor APTX in DNA Double Strand Break Repair (2023)
  • 著者名/発表者名: Rikiya Imamura, Mizuki Saito, Mikio Shimada, Masamichi Ishiai, Yoshihisa Matsumoto
  • 学会等名: International Symposium on Zero-Carbon Energy Systems
  • 国際学会
• [学会発表] Analysis of the phosphorylation mechanism of the C-terminus of XRCC4 in DNA double-strand break repair (2023)
  • 著者名/発表者名: 村松 麗斗, 塚田 海馬, 西内 巧, 島田 幹男, 松本 義久.
  • 学会等名: 日本原子力学会関東・甲越支部第21回若手研究者・技術者研究討論会
• [学会発表] DNA損傷と細胞周期 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松本 義久
  • 学会等名: 日本放射線腫瘍学会生物部会 第13回放射線生物学セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] Molecular Radiation Biology on DNA Damage Response for Radiotherapy and Radioprotection in Next Generation (2022)
  • 著者名/発表者名: Yoshihisa Matsumoto.
  • 学会等名: 5th Asian Congress of Radiation Research
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Role of genetic disease factor APTX in DNA double strand repair (2022)
  • 著者名/発表者名: Rikiya Imamura, Mizuki Saito, Mikio Shimada, Masamichi Ishiai, Yoshihisa Matsumoto.
  • 学会等名: 5th Asian Congress of Radiation Research
  • 国際学会
• [学会発表] DNA二重鎖切断の認識・修復の分子機構とがん治療への応用 (2022)
  • 著者名/発表者名: 松本 義久.
  • 学会等名: 第27回癌治療増感研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 遺伝性疾患原因遺伝子APTX のDNA 二本鎖切断修復での役割 (2022)
  • 著者名/発表者名: 今村 力也, 齋藤 瑞樹, 島田 幹男, 石合 正道, 松本 義久.
  • 学会等名: 日本放射線影響学会第65回大会
• [備考] 東京工業大学 科学技術創成研究院 ゼロカーボンエネルギー研究所 松本研究室
  • URL: http://www.nr.titech.ac.jp/~yoshim/