| 研究課題/領域番号 |
20H04342
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
古武 弥一郎 広島大学, 医系科学研究科(薬), 教授 (20335649)
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| 研究分担者 |
佐能 正剛 広島大学, 医系科学研究科(薬), 助教 (00552267)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 核呼吸因子-1 / 毒性評価系 |
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| 研究実績の概要 |
これまでNRF-1活性を評価するには煩雑な方法しかなく、本評価指標を初期段階でスクリーニングに用いるには、簡便な評価系が必要であった。そこで本年度は、NRF-1活性を簡便に評価できるレポーター細胞（N-Rep細胞）を作製した。具体的には、Luc2遺伝子の下流に自己切断ペプチドP2Aと蛍光タンパク質EGFPを連結してプロメガ社のpGL4.23ベクターに組み込み、ルシフェラーゼの発光とEGFPの蛍光の両方でプロモーター活性を検出できるN-Rep細胞（安定発現系と一過性発現系の２種類）を作製した。安定発現株には内部標準遺伝子として導入したウミシイタケルシフェラーゼの発現量が多すぎるなどの問題があったため、一過性発現系を用いてNRF-1活性評価系を構築した。24ウェルプレートで培養したマウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞に、作製したレポータープラスミドを用いて野生型NRF-1またはドミナントネガティブNRF-1を発現させた。その結果、NRF-1の活性に応じて、ホタルルシフェラーゼ由来の発光やEGFP由来の蛍光が変化することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
特にin vitroの評価系構築が進んでいるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．NRF-1評価細胞を用いた簡便・効率的なNRF-1低下物質探索
作製したNRF-1活性を簡便に評価できるレポーター細胞を用いて、低濃度でNRF-1活性を阻害する環境化学物質を探索する。具体的には、作製したNRF-1応答性レポーター細胞に様々な濃度の評価物質（農薬・重金属・工業化学物質など申請者が有する環境化学物質ラ
イブラリー）を曝露し、低濃度で持続的にNRF-1活性を阻害する物質を探索する。
２．NRF-1低下細胞を用いた影響評価
NRF-1はノックアウトマウスが耐性致死であり、約1,000の下流遺伝子が想定されていることからも、生体にとって重要なはたらきをしている転写因子であることが予想される。しかしながら、その機能はあまり明らかとなっていない。そこで、NRF-1を発現低下させたノックダウン細胞を用いて、GluA2低下以外にNRF-1が低下した際の影響を調べる。
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