| 研究課題/領域番号 |
20H04506
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| 研究機関 | 九州工業大学 |
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研究代表者 |
安田 隆 九州工業大学, 大学院生命体工学研究科, 教授 (80270883)
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| 研究分担者 |
廣瀬 伸一 福岡大学, 医学部, 教授 (60248515)
桂林 秀太郎 福岡大学, 薬学部, 教授 (50435145)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | マイクロデバイス / 微小孔 / 微小電極 / ニューロン / アストロサイト / 共培養 / 単一細胞解析 / 細胞外電位計測 |
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| 研究実績の概要 |
微小孔アレイを有する窒化シリコン（SiN）膜上で単一ニューロンを培養する技術を構築するために、PDMS製のマイクロウェル（直径300μm）を8×8個のアレイ状に形成し、多数の微小孔（直径3μm）を有するSiN自立膜（厚さ1μm）で各ウェルの底面を構成した。ウェル内の膜表面に単一ニューロンを、膜裏面に多数のアストロサイトを培養した。共培養8日後に、ニューロンのβIIIチューブリン及びシナプスに局在するVGLUT1を蛍光染色し、神経突起に沿って多数のシナプスが形成されていることを確認した。複数のウェル内における神経突起長とシナプス数を計測し比較したところ、神経突起長が長いほどシナプス数が多くなる結果が得られ、両者の間に相関関係があることが示唆された。
マイクロウェル・アレイの各ウェル内に単一ニューロンを効率的に播種する技術を構築するために、マイクロ流路底面にニューロンより小さな微小孔をアレイ状に形成して、マイクロ流路内の流量調節により微小孔に単一ニューロンを吸引捕捉した後に吐出・播種する技術を構築した。基礎的な評価のためにニューロンの代わりにHeLa細胞を用い、直径5～10μmの各微小孔における捕捉と吐出の特性を調べた。その結果、孔径8μmで捕捉の成功率が最も高くなり、孔径が小さい方が吐出し易いことが分かった。
微小孔アレイを有するSiN膜上の微小電極を用いて単一ニューロンの細胞外電位を計測する技術を構築するために、微小電極の形状と配置、微小孔アレイの配置の変更を行った。膜裏面にアストロサイトを培養した後に、膜表面（電極形成面）にニューロンを低密度で培養したところ、微小電極上で単一ニューロンを培養することに成功し、共培養8日目に単一ニューロンの電気的活動と思われる電位波形を記録した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
交付申請書の研究実施計画に記載した、単一ニューロン培養系構築の歩留まりとスループットを向上させるためのマイクロウェル・アレイへの細胞播種技術の構築、単一ニューロンの細胞外電位を計測するための微小電極上における単一ニューロン培養技術の構築などにおいて、当初の目標としていた成果を得ることができたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
微小孔アレイを有するSiN膜上で単一ニューロンを培養する技術を構築するために、以下の研究を実施する。SiN製多孔膜を底面に有するSi製マイクロウェルをアレイ化し、これまでよりウェル数を増やすとともに、ニューロンの播種方法等を最適化し、1デバイス上でより多くの単一ニューロン培養系を形成する技術を構築する。SiN膜裏面に適切な密度でマウス由来アストロサイトを培養した後に、各ウェル底面のSiN膜表面にマウス由来単一ニューロンを培養する。ニューロンとシナプスを免疫染色し、軸索の長さやシナプス数を計測することで、単一ニューロンの活性の経時変化を定量的に評価する。
次に、微小孔アレイを有するSiN膜上で単一のiPS細胞から単一のニューロンを分化誘導する技術を構築するために、以下の研究を実施する。上記で構築したマイクロウェル・アレイのSiN膜裏面にマウス由来アストロサイトを培養した後に、グルタミン酸作動性ニューロンへの分化誘導を施した単一のiPS細胞をマイクロウェル内のSiN膜表面に培養する。単一iPS細胞の生存率、単一ニューロンへの分化の成功率、単一ニューロンの生理活性などを免疫染色等により定量的に評価する。
さらに、微小孔アレイを有するSiN膜上の微小電極を用いて単一ニューロンの細胞外電位を計測する技術を構築するために、以下の研究を実施する。微小電極の形状、微小電極と微小孔の配置などの最適化を目指して、微小電極上における単一ニューロンの培養状態の経時変化を評価するとともに、単一ニューロンの細胞外電位を計測し、微小電極及び微小孔の設計にフィードバックする。
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